Préparation de petites quantités d'ADN plasmidique

Réactifs expérimentaux

1. SOLUTION I
50 mmol / L de glucose
25 mmol/L Tris.Cl (pH 8,0)
10mmol/LEDTA(pH8,0)
La solution I peut être formulée en lots d'environ 100 ml par flacon à 6895 × 10⁴PA stérilisé à la vapeur sous haute pression pendant 15 minutes, stocké à 4 ° c.

2. Solution II
0,2 mol / l NaOH (dilué avec 10 mol / L de réservoir avant utilisation provisoire)
1 % SDS

3. Solution Ⅲ
5mol / l acétate de potassium 60ml
Acide acétique glacial 11,5 ml
水 28.5ml
La solution associée est de 3 mol / l pour le potassium et de 5 mol / l pour l'acétate.

4. Stett
0,1 mol/L de NaCL
10mmol/L Tris.Cl(pH8,0)
1 mmol/L EDTA (pH 8,0)
5 % Triton X-100

5. * Solution
10mg/ml， Formulé avec 10 mmol / L de tris.cl (pH 8,0).

Étapes expérimentales

1. Récolte des bactéries
1) Ajouter 2 ml de LB avec l'antibiotique correspondant dans un tube de 15 ml de capacité et bien aéré (non bouché), puis accéder à une seule colonie et incuber une nuit à 30 ° C sous agitation vigoureuse.
2) verser 1,5 ml de la culture dans un tube de microcentrifugation, centrifuger à 12000 G à 4 ° C pendant 30 secondes avec une microcentrifugeuse et stocker le reste de la culture à 4 ° c.
3) aspirer le liquide de culture pour que la précipitation bactérienne soit aussi sèche que possible. Le moyen facile d'éliminer le nettoyage supérieur consiste à utiliser une tête d'aspiration à usage unique connectée à un tuyau de vide, à aspirer doucement et à toucher le niveau du liquide avec la tête d'aspiration. Lorsque le liquide est aspiré hors du tube, éloignez autant que possible la tête d'aspiration de la précipitation bactérienne, puis continuez à éliminer les gouttelettes collées à la paroi du tube par aspiration avec la tête d'aspiration.
2. Méthode de craquage alcalin
1) Les bactéries sont précipitées et le résultat remis en suspension dans 100 µl de solution I préalablement refroidie avec de la glace, sous forte agitation. Il faut s'assurer que le précipité bactérien est dispersé dans la solution I *, que le fond des tubes des deux tubes de microcentrifugation est en contact avec la commotion, ce qui permet une dispersion rapide du précipité.
2) ajouter 200 µl de la solution II fraîchement formulée. Fermer l'embout et inverser rapidement le tube de centrifugation 5 fois pour mélanger le contenu. Il faut s'assurer que toute la surface intérieure du tube de centrifugation est en contact avec la solution II. Ne pas osciller, placez le tube de centrifugation sur la glace.
3) Ajouter 150 μl de la solution Ⅲ pré - refroidie avec de la glace, fermer l'embouchure du tube, disperser uniformément la solution Ⅲ dans un lysat bactérien visqueux après inversion du tube et oscillation de la terre pendant 10 secondes, après quoi le tube est placé sur la glace pendant 3 - 5 minutes.
4) centrifuger 5 fractions à 4 ℃ 12 000g avec une microcentrifugeuse, transférer le surnageant dans un autre tube de centrifugation.
5) faire ou ne pas faire: ajouter une quantité égale de phénol:, mélanger à l'oscillation, centrifuger à 12000g avec une microcentrifugeuse à 4 ℃ pendant 2 minutes, transférer le surnageant dans un autre tube de conscience. Certains travailleurs pensent que non * phénol: effectuer une extraction, mais pour des raisons inconnues, en omettant cette étape, on a tendance à obtenir de l'ADN qui tolère la restriction de la réaction de coupure enzymatique.
6) l'ADN double brin est précipité à température ambiante avec 2 fois l'éthanol réticulé. Mélanger sous agitation et laisser reposer 2 minutes à température ambiante.
7) centrifuger à 12 000 g à 4°C pendant 5 minutes avec une microcentrifugeuse.
8) aspirez soigneusement le surnageant et placez le tube de centrifugation à l'envers sur une serviette en papier pour que tout le liquide s'écoule. Retirez à nouveau les gouttelettes fixées à la paroi du tube. Un moyen facile d'éliminer le dégagement supérieur consiste à connecter le tuyau de vide avec une tête d'aspiration à usage unique et à toucher le niveau du liquide avec la tête d'aspiration. Lorsque le liquide est aspiré hors du tube, essayez d'éloigner la tête d'aspiration de l'acide nucléique pour la précipitation, puis continuez à éliminer les gouttelettes collées à la paroi du tube par aspiration avec la tête d'aspiration.
9) Le précipité d'ADN double brin est lavé avec 1 mL d'éthanol à 70% à 4°C, le surnageant est éliminé selon la méthode opératoire de l'étape H et le précipité d'acide nucléique est laissé sécher à l'air pendant 10 minutes.

Note:
Les plasmides à haut nombre de copies (tels que xf3 ou PUC) préparés par cette méthode ont généralement un rendement d'environ: 3 - 5 μg par ml de culture de protobactères.
Si l'ADN doit être analysé en limitant la réaction de clivage enzymatique, il est souhaitable d'ajouter 1 μl de solution d'ADN à l'intérieur d'un autre tube de microcentrifugation contenant 8 μl d'eau, plus 1 μl de tampon enzymatique de restriction 10 × et 1 unité de l'enzyme de restriction requise à une incubation appropriée pendant 1 à 2 heures. Le reste de l'ADN est stocké à - 20°C.
3. Cette méthode agrandie dans les proportions appropriées peut être appliquée à 100 ml de culture bactérienne:

3. Bouillir et craquer

1) Les bactéries sont précipitées et le résultat est remis en suspension dans 350 µlstet.

2) Ajouter 25 μl de la solution fraîchement formulée * et agiter pendant 3 secondes pour mélanger. Si le pH est inférieur à 8,0 dans le Huai dissous *, il ne peut pas fonctionner efficacement.
3) placez le tube de centrifugation dans un bain d'eau bouillante pendant exactement 40 secondes.
4) centrifuger 10 fractions à 12 000 g à température ambiante avec une microcentrifugeuse.
5) enlever les débris bactériens du tube de microcentrifugation avec un cure - dent stérile.
6) Ajouter 40 µl d'acétate de sodium 5 mol / L (pH 5,2) et 420 µl d'Isopropanol dans le surnageant, mélanger sous agitation et laisser 5 minutes à température ambiante.
7) centrifuger 5 fractions à 12 000 g à 4°C avec une microcentrifugeuse et récupérer le précipité d'acide nucléique.
8) aspirez soigneusement le surnageant et placez le tube de centrifugation à l'envers sur une serviette en papier pour que tout le liquide s'écoule. Retirez à nouveau les gouttelettes fixées à la paroi du tube. Le moyen facile d'éliminer le nettoyage supérieur consiste à utiliser une tête d'aspiration à usage unique connectée à un tuyau de vide, à aspirer doucement et à toucher le niveau du liquide avec la tête d'aspiration. Lorsque le liquide est aspiré hors du tube, la tête d'aspiration est décantée aussi loin que possible de l'acide nucléique, puis les gouttelettes collées au tube sont éliminées par aspiration avec la tête d'aspiration.
9) Ajouter 1 mL d'éthanol à 70% et centrifuger à 12 000 g à 4°C pendant 2 minutes.
10) aspirer à nouveau doucement pour enlever le déblaiement comme décrit à l'étape H, cette étape est effectuée avec une extrême prudence, car parfois le bloc de précipitation n'est pas collé étroitement, enlever toutes les gouttelettes d'éthanol formées sur la paroi du tube, ouvrir l'embouchure du tube, placer à la température de la chambre Jusqu'à ce que l'éthanol soit volatilisé, aucun liquide visible (2 - 5) à l'intérieur du tube pendant une minute.
11) dissoudre l'acide nucléique avec une légère Oscillation avec 50 µl de te (pH 8,0) contenant de l'arnpase pancréatique sans DNase (20 µg / ML) stockée à - 20°C.
Note: lorsque l'ADN en particulier est granulé en petites quantités à partir de souches d'e. Coli exprimant l'endonucléase a (souches Enda telles que HB101), il est recommandé d'abandonner la méthode d'ébullition. Parce que l'étape d'ébullition ne peut pas * inactiver l'endonucléase a, plus tard en mg² L'ADN plasmidique peut être dégradé en présence d'une incubation (lorsque l'enzyme de restriction est utilisée en V). L'ajout d'une étape entre les étapes I du Protocole ci - dessus, c'est - à - dire avec le phénol: le retrait est effectué, ce qui permet d'éviter ce problème.