06,02,2026 20vues
Contexte de la recherche:
Le cancer colorectal est l'un des cinq cancers les plus meurtriers au monde et la deuxième tumeur maligne la plus fréquente en Chine. Les métastases hépatiques sont la principale cause de mauvais pronostic pour les patients,25%Les patients ont eu des métastases hépatiques au moment de la première consultation, après la chirurgie15% - 25%Récidive due aux métastases hépatiques,90%Les patients atteints de métastases hépatiques n'ont pas accès à un traitement efficace,IVPatients en phase5Taux de survie annuel seulement24%- Oui.N-Les modifications glycosylées jouent un rôle clé dans de nombreuses fonctions des protéines et sont associées à des métastases malignes, mais sont actuellement associées à des métastases hépatiques dans le cancer colorectalN-La protéomique glycosylée est moins étudiée.
Méthodes de recherche:
Collecte14Exemples de foyers primaires et de foyers de métastases hépatiques appariés chez des patients atteints de métastases hépatiques du cancer colorectal traités par chromatographie liquide-Spectrométrie de masse (LC-MS) analyse. Culture de plusieurs lignées cellulaires, constructionCTSDMutants, opérant par transfection, infection, etc., pour effectuer des expériences sur la prolifération cellulaire, la migration, l'invasion, l'apoptose, etc. Construire des modèles de tumeurs sous - cutanées et de métastases hépatiques chez la souris nue et observer la croissance tumorale et les métastases.
Principaux résultats de recherche:
1.CRCLes patients présentant des lésions métastatiques hépatiques plus élevées que les lésions primairesCTSD N-Niveau de Glycation
Grâce à la spectrométrie de masse, les chercheurs ont comparé14Cas de lésions primaires et14Exemple de lésions métastatiques hépatiques appariéesN-Différences dans les modifications glycosylées, co - détectées139EspèceN-Protéines glycosylées,185unN -Sites modifiés de glycosylation,490Une structure complèteN-Glycopeptides et71Base de sucre. Parmi lesquels46unN-Le site modifié de glycosylation n'a pas été précédemmentUniprotRapport de la plateforme. Dans les foyers de métastases hépatiques, il y a13Un site deN-Changement du niveau de modification de glycosylation au - delà de1.5Le multiple.N-La séquence d'acides aminés autour du site de glycosylation présente une certaine conservation.44,94%DeN-Le site de glycosylation est modifié par une seule base glycosylée fixe,20,86%DeN-Glycoprotéines contiennent plusieursN-Site modifié de glycosylation. Avec l'aideAllezetKEGGL'analyse a révélé que cesN-Les protéines glycosylées peuvent appartenir aux protéines sécrétées et aux protéines membranaires. En ce qui concerne les processus biologiques, principalement impliqués dans l'adhésion intercellulaire, la protéolyse et la réponse immunitaire, entre autres; La fonction moléculaire est principalement liée à l'activité de liaison.KEGGL'analyse d'enrichissement des voies suggère qu'elles peuvent impliquer des lysosomes, des matrices extracellulaires-Interactions récepteurs et médicaments-Voies connexes telles que les récepteurs. En outre, dans leCathepsine D(CTSD) de263Au niveau du résidu, on trouve 2488.06545(Précurseur MH) commeH (6) N (2)La modification structurale des glycosyles est la plus élevée en termes absolus dans les foyers métastatiques hépatiques par rapport aux foyers primaires. En même temps,H (5) N (2)etH (7) N (2)DeN-Le niveau de modification glycosylée a également augmenté de manière significative dans les lésions métastatiques hépatiques, ce qui suggère que dans les lésions métastatiques hépatiquesCTSD第263Du résidu de positionN-Le niveau global de modification glycosylée est plus élevé que dans les foyers primaires.
Image1Cancer colorectal dans les foyers primaires et les foyers métastatiques hépatiques appariésN -Analyse pertinente des protéines glycosylées
2. CTSDCaractéristiques de modification de glycosylation et effets des mutations de sites associées sur les protéines
à5ExempleCRCLes foyers primaires et les foyers de métastases hépatiques appariés du patient sont testés, trouvés dans les foyers de métastases hépatiquesCTSDDeN -Le niveau de glycosylation est plus élevé que dans les foyers primaires. En même temps, dans plusieursCRCÉvaluation dans les lignées cellulairesCTSDLe niveau de glycosylation,CTSDDans différentsCRCIl existe des différences dans les niveaux de glycosylation dans les lignées cellulaires. utiliserPNGase FEt après traitement de la lignée cellulaire par la lichinomycine,CTSDDiminution du poids moléculaire, indiquantCTSDPrésenceN-Modification glycosylée et passage d'une forme glycosylée à une forme non glycosylée après traitement. Analyse des résultatsCTSDDans les résidus Asparagine 263(N263), avec Conservation évolutive.UniProtPrévision de la base de données des protéinesCTSDavoir2Un potentielN-Sites de glycosylation (résidus d'acide aspartique134et263). Par la suite dansSW480etSW620Endogène silencieux dans les lignées cellulairesCTSDExpression, rediduction séparée codant le type sauvageCTSD(CTSD WT), ou mutantsCTSD(CTSD N263QEt,CTSD N134Q/N263Q), un plasmide exogène, construit avec succès un modèle cellulaire d'expression stable. Par contraste avant et après mutation et menstruationPNGase FTraitéesCTSDChangement de poids moléculaire, déterminationCTSDUniquement dans les résidus 134et263La présence du lieuN-Site modifié de glycosylation.
Image2 CTSD N-Validation des sites modifiés de glycosylation
3.CTSD N263Promotion de la modification glycosylée du siteCRCCroissance et transfert
SeraCTSDType sauvage (WT) etN263QMutant (non glycosylé)SW480Les cellules sont injectées par voie sous - cutanée séparément à des souris nues, les résultats des expériences tumorigènes montrentCTSD WTLe volume de la tumeur du Groupe est significativement plus grand queN263QGroupe, et la tumeur apparaît plus prononcée et pèse plus lourd. Dans un modèle de souris nues métastasées hépatiques,WTLe Groupe de rats nus avait des nodules de transfert visibles à la surface du foie, tandis queN263QGroupe de foie sans foyer de transfert visible à l'œil nu;HEAffichage de teintureWTPrésence de foyers de transfert typiques dans le foie du Groupe,N263QGroupe tissu hépatique normal, aucun signe de métastase, indiquantCTSDDansN263Du siteN -La modification glycosylée est sa promotionCRCFacteurs clés de la croissance et des métastases hépatiques, absence de cette modification (N263QMutations) entraînent une diminution de la capacité de prolifération tumorale, un ralentissement significatif de la croissance tumorale sous - cutanée, une perte de potentiel métastatique.
Image3 CTSD N263Site de modification de glycosylation vérification du siteCRCEffets de la croissance et des transferts
4.CTSD N-Effets des modifications glycosylées sur leur localisation cellulaire, leur stabilité et leur activité fonctionnelle
GeneCardsafficherCTSDPrincipalement distribué dans la matrice extracellulaire, les lysosomes et les endosomes. Des expériences d'immunofluorescence découvrent le type sauvage (WT) etCTSDAvec marqueurs lysosomauxLAMP1Marqueurs endosomiques précocesEEA1Marqueurs endosomiques tardifsRab7Co - localisation indiquant son transport normal vers les lysosomes et les endosomes; Et les mutants (N263QEt,N134Q / N263Q) etCTSDPerte de la capacité de co - localisation avec les marqueurs ci - dessus, rétention dans le cytoplasme ou mauvaise localisation. Un seul Mutant (N263Q) etCTSDSécrétion significativement inférieure àWTCellules, conseilsN263L'absence de glycosylation inhibe sa sécrétion; Et double Mutant (N134Q / N263Q) etCTSDLa sécrétion est au contraire supérieure àWTCellules, suggérant que la délétion de glycosylation bi - site peut libérer un certain mécanisme d'inhibition de la sécrétion. Cyclohexyliyaun(CHX) affichage du suiviWT CTSDDans le traitement5Le niveau reste élevé après l'heure, avec une longue demi - vie,N263QMutantsCTSDDans le traitement3Dégradation significative après l'heure et demi - vie réduite. utiliserCTSDSubstrats spécifiques (GKPILFFRLK (Dnp)-D-R-NH2), et la détection par fluorescence,WT CTSDL'activité enzymatique est significativement plus élevée queN263QetN134Q / N263QMutants, activité enzymatique faible pour les mutants doubles et secondaire pour les mutants simples, suggérant que le nombre de sites de glycosylation est positivement corrélé à l'activité enzymatique. Cela montreN263La glycosylation estCTSDEntrer dans les lysosomes/Conditions nécessaires pour les endosomes, assurer leur fonctionnement dans un environnement acide, glycosylation inhibe la dégradation des protéines, prolongerCTSDDemi - vie et affecte directementCTSDEfficacité catalytique, favorise sa fonction protéase. En outre,N263Les sites jouent un rôle dominant dans la régulation de la localisation et de la stabilité, tandis queN134Peut affecter la sécrétion et l'activité enzymatique par une action synergique.
Image4 CTSD第134et263De positionN-La glycosylation régule sa position de pliage, sa stabilité et son activité fonctionnelle
5. CTSD N-Étude des mécanismes de régulation des modifications glycosylées
Puis enquêteCTSDDeN-Les mécanismes de régulation de la modification de la glycosylation se concentrent sur l'identification des complexes de transférases et des sous - unités clés impliquées dans leur glycosylation. UtilisationdrapeauEnrichissement d'étiquettesCTSDType sauvage (WT) etN263QProtéine interopérable du mutant, par analyse de la protéine de liaison différentielle par spectrométrie de masse, trouvéCTSD WTCombinaison spécifique235Les protéines,N263QCombiné191Les protéines, dont45Protéine uniquement avecWTL'interaction, dontDDOSTOuiN -Glycosyltransférase.N -Glycosylation à partir d'Oligosaccharides transférases dans le Réticulum endoplasmique (OST) complexes, divisés enOST-A(sous - unités catalytiquesSTT3A) etOST-B(sous - unités catalytiquesSTT3B), sous - unités non catalytiques telles queDDOSTPeut stabiliser la liaison du complexe au substrat. Par la suite, parCPTACL'analyse de la base de données a révélé,STT3AEt,STT3BetDDOSTUne expression significativement élevée dans les tissus du cancer du côlon suggère qu'il est associé àCRCLe progrès est lié. DansSW480Knockout dans les cellulesSTT3BouDDOSTAprès,CTSDRéduction significative du poids moléculaire, indiquantN-Absence de modification glycosylée; Et KnockoutSTT3AAucun changement notable. La découverte de la validation de la co - précipitation immunitaire,CTSD WTAvecSTT3BEt,DDOSTInteraction significative, etN263QLa capacité du Mutant à se lier aux deux est significativement diminuée,CTSDAvecSTT3AAucune liaison évidente, indiquantSTT3BEst la principale sous - unité catalytique. De plus, les résultats de la co - localisation par immunofluorescence montrent queCTSDAvecSTT3BEt,DDOSTCo - localisation significative dans les régions du Réticulum cytoplasmique et endoplasmique, tandis queSTT3APas de co - localisation.
Image5 CTSD N-Identification des glycosyltransférases
6. CTSDDeN-Modification de glycosylation par dégradationACADMRégulation de la promotion de la mort par le ferCRCMécanismes moléculaires du transfert hépatique
Par comparaisonCTSDType sauvage (WT) etN263QType de mutationSW480Protéome des cellules, identifié par criblage391Une protéine d'expression différentielle (les DEP), dontWTLes protéines moyennement et fortement exprimées sont principalement enrichies par des voies telles que l'activité protéase, la migration cellulaire,N263QLes protéines moyennement et fortement exprimées sont impliquées dans le métabolisme des acides gras, les réactions antioxydantes, etc., parCTSD WTProtéines d'interaction spécifiques avecles DEPAnalyse d'intersection, filtrage préliminaire8Une molécule candidate:ACADMEt,PRDX3Et,ALDH2Et,ErhardEt,DHCR7Et,Tgfb1i1Et,Idh2Et,ALDH1A1. L'analyse de pertinence clinique montre,ACADMetPRDX3Le pronostic des patients à haute expression est significativement supérieur à celui des patients à faible expression, suggérant que les deux peuvent être des facteurs suppresseurs de cancer;TNMAnalyse de Staging trouvéACADMExpression avecCRCDegré de malignité (TNMStadification) La progression diminue, dans les métastases hépatiques (IVPhase) Expression faible chez les patients, indiquantACADMNégativement associé au transfert, il a donc été choisi comme cible de recherche ultérieure. DansCTSD WTetN263QDans les cellules,CTSDLe niveau d'expression est comparable, maisN263QDe la celluleACADMNiveaux de protéines significativement élevés, conseilsCTSDPromotion de la glycosylationACADMDégradation. En outre,Co-IPLes résultats montrentCTSD WTAvecACADMCombinaison significative, tandis queN263QLes mutants ne peuvent pas être associés àACADMInteragir, montrerCTSDDeN263La glycosylation est sa liaison et sa dégradationACADMLes prémisses. Enfin, dans le90 ExempleCRCDans l'Organisation,CTSDExpression etACADMSignificativement corrélés négativement, et les deux co - localisés dans le cytoplasme, vérification supplémentaireCTSDàACADML'effet de dégradation est omniprésent dans les échantillons cliniques.
Image6 CTSD N263-Effets des modifications glycosyléesCTSDPaire de protéasesACADMEffet protéolytique
Conclusions de l'étude:
Cette étude se concentre sur le cancer colorectal dans les métastases hépatiquesN-Mécanisme de modification de la glycosylation,CTSDDeN263La glycosylation du site est significativement régulée à la hausse dans les foyers de transfert hépatique, cette modification étant provoquée parSTT3BetDDOSTRégulation du complexe glycosyltransférase.CTSDLa glycosylation favorise la dégradation en maintenant sa localisation lysosomale, sa stabilité et son activité protéasiqueACADMProtéines, qui régulent à leur tour les protéines liées à la mort du fer (ACSL4Et,SLC7A11Et,GPX4), renforcéeCRCCapacité des cellules à envahir le transfert. Les expériences in vivo montrent, KnockoutN263La glycosylation inhibe la croissance tumorale et les métastases hépatiques chez les souris nues. L'étude révèleCTSD-N263Glycosylation par« STT3B/DDOST-ACADM-Axe de la mort de fer« etDrive Transfer, pourCRCLe traitement fournit de nouvelles cibles et une base théorique.
Carte mentale de la recherche:
Références:
Xiong N, Du Y, Huang C, Yan Q, Zhao L, Yang C, Sun Q, Gao Z, Wang C, Zhan J, Zhang H, Wang S, Ye Y, Li Y, Shen Z. Adv Sci (Weinh). 2025 février; 12(7): e2411740. doi: 10.1002/advs.202411740. Epub 2024 24 décembre. PMID: 39716927; PMCID : PMC11831497.
