Cosmétiques in vitro collagène synthèse promotion test

Cosmétiques in vitro collagène synthèse promotion test

Principe de détection et voie technique

Le collagène est l'ingrédient central dans le maintien de l'élasticité de la peau et sa capacité à synthétiser affecte directement les fonctions anti - rides et réparatrices de la peau. Le test cosmétique in vitro de promotion de la synthèse du collagène évalue l'effet stimulant des sujets sur la biosynthèse du collagène en établissant un modèle de culture de fibroblastes simulant l'environnement physiologique du derme cutané. Ce système de détection a fait l'objet d'études sur des fibroblastes dermiques humains (HDF) ou sur des lignées fibroblastiques immortalisées (par example nhdf) soumis à des conditions de culture standardisées (37°c, 5% de co₂, 95% d'humidité) permettant de vérifier à la fois le niveau protéique et le niveau génétique des modifications de la capacité de synthèse du collagène après intervention sur des tests.

La conception expérimentale utilise une méthode de gradient de concentration (généralement trois groupes de doses de 0,01%, 0,1%, 1%) avec un contrôle à blanc (sans milieu sérique) et un contrôle positif (vishengine C 100 μmol / l) configurés de manière synchrone, assurant la comparabilité et la fiabilité des résultats. Le principe technique clé repose sur la régulation à la hausse de l'expression du gène col1a1 par les fibroblastes, stimulés par le principe actif, favorisant la sécrétion de collagène de type I en activant la voie de signalisation TGF - bêta / Smad. Les tests sont soumis à une validation cytotoxique synchronisée (méthode MTT) qui exige que les sujets aient une survie cellulaire > 80% à des concentrations efficaces, excluant toute interférence de la prolifération cellulaire ou de la toxicité dans les résultats des tests.

Méthodes de détection de base et processus normalisés

Quantification des niveaux de protéines: détermination de la teneur en collagène de type I par ELISA

La détection spécifique de la concentration de collagène de type I (col1) dans les surnageants de culture cellulaire par immunoadsorption enzymatique (ELISA) est appliquée et le processus opératoire suit strictement les spécifications techniques de GB / t 35828 - 2018, directives pour les tests d'efficacité in vitro de modèles de peau 3D cosmétiques. Les étapes spécifiques comprennent:

Prétraitement de l'échantillon: prélèvement du surnageant cellulaire intervenant pendant 72 heures, centrifugation à 4°C à 12 000 tr / min pendant 10 minutes pour éliminer les impuretés;

Le pack d'anticorps a été: pack de plaques 96 puits par anticorps monoclonal murin anti - Col1 humain (dilution 1: 1000), incubé à 4°C pendant une nuit;

Liaison antigénique: ajouter des échantillons dilués dans un gradient et des étalons (0 - 200 ng / ML), incuber à 37 ° C pendant 2 heures;

Réaction de rendu des couleurs: ajout séquentiel d'un anti - deux marqué HRP (dilution 1: 2000) et d'un substrat TMB, détermination de l'Absorbance à une longueur d'onde de 450 nm après arrêt de la réaction;

Calcul des données: les taux de synthèse relatifs ont été calculés par comparaison entre le Groupe expérimental et le groupe témoin en convertissant les concentrations de Col1 à l'aide d'une courbe standard, ce qui nécessite une augmentation ≥ 20% (p < 0,05) de la teneur en Col1 du Groupe de résultats positifs par rapport au témoin vierge.

Vérification du niveau génétique: PCR en temps réel pour détecter l'expression de col1a1

Pour découvrir les mécanismes moléculaires de la synthèse du collagène, les changements de niveau de transcription du gène col1a1 doivent être détectés par PCR quantitative par fluorescence en temps réel (QPCR), le processus expérimental étant le suivant:

Extraction totale d'ARN: lyse des cellules par la méthode trizol, dosage de la concentration d'ARN par NanoDrop (rapport a260 / A280 1,8 - 2,0);

Réaction de transcription inverse: synthèse de l'adnc avec le kit primescript RT dans des conditions réactionnelles de 37°c pendant 15 minutes et 85°c pendant 5 secondes;

Amplification par QPCR: GAPDH en tant qu'endogène de ginseng, séquence d'amorce col1a1 F: 5 '- gagggccaagacgaagacatc - 3', R: 5 '- cagtcacgtcatcgacatacatc - 3', amplification réalisée dans le système lightcycler 480 (pré - dénaturation à 95°c pendant 10 minutes, 40 cycles: 95°c pendant 15 secondes, 60°C pendant 30 secondes);

Analyse des résultats: l'expression relative de col1a1 a été calculée par la méthode 2 ^ (- ΔΔct) et l'expression du gène a été régulée à la hausse par un facteur ≥ 1,5 chez les sujets positifs, en accord avec la tendance à la variation des taux de protéines.

Contrôle de la qualité et critères de décision des résultats

Contrôle qualité du système expérimental

Assurance de la qualité cellulaire: utilisation de cellules en phase de croissance logarithmique de génération 3 à 10, densité d'inoculation contrôlée à 5 × 10 ⁴ cellules / cm², assurant un taux d'application cellulaire > 90%;

Standardisation des réactifs: le sérum de veau foetal doit être testé par mycoplasme, la concentration de Dan - leucose pancréatique est strictement contrôlée à 0,25% et la quantité d'EDTA ajoutée à 0,02%;

Exigences de précision de l'instrument: fluctuation de la température de l'incubateur co₂ ≤ ± 0,1 ℃, maintien du pH 7,2 - 7,4. La table de travail ultra - propre doit atteindre la pureté de classe ISO 5 (particules en suspension ≤ 3520 / m³);

Vérification méthodologique: précision intra - Lot RSD < 8%, précision inter - Lot RSD < 12%, taux de récupération 90% - 110% selon la méthode ELISA; Efficacité d'amplification QPCR 90% - 110%, coefficient de corrélation R² > 0,99.

Seuil de décision des résultats

Critères de décision de base: un sujet peut être jugé positif à une concentration non cytotoxique (survie > 80%) Si l'une des conditions suivantes est remplie:

La teneur en collagène de type I a augmenté de ≥ 20% par rapport au témoin vierge (méthode ELISA, p<0.05);

Expression du gène col1a1 régulée à la hausse ≥ 1,5 fois (méthode QPCR, p<0.05)。

Exigences de validation renforcées: pour les produits revendiquant une « amélioration significative de la synthèse du collagène », une augmentation des taux de protéines ≥ 30% et une augmentation des taux de gènes ≥ 2 fois doivent être satisfaites simultanément, et au moins 3 répétitions expérimentales indépendantes doivent être fournies.

Agence d'inspection avantages techniques et garantie de conformité

Installations matérielles et capacités techniques

Le Centre de détection zhongko est équipé d'un laboratoire de biosécurité à trois niveaux, avec un équipement de base comprenant:

Système de culture cellulaire entièrement automatisé (thermo Scientific heracell VIOS): surveillance et alarme en temps réel de la température et de la concentration de co₂;

Station de travail ELISA à haut débit (biotek 800ts): prend en charge la détection simultanée de 96 échantillons avec des limites de détection aussi faibles que 0,1 pg / ML;

PCR quantitative à fluorescence (roche lightcycler 96): équipé d'un module de température à montée et descente rapides, une seule expérience peut être réalisée en 2 heures;

Système d'imagerie cellulaire (Olympus ix73): analyse quantitative de l'intensité de l'immunofluorescence du collagène en combinaison avec le logiciel imagej.

Droit Wei qualification et crédibilité des données

Le laboratoire est accrédité par le CNAS (certificat n° CNAS l22006) et accrédité CMA, le processus d’essai suit rigoureusement:

Norme nationale: GB / t 35828 - 2018 Guide de test de modèle de peau in vitro pour les cosmétiques;

Spécifications internationales: OCDE TG 439, test d’irritation cutanée in vitro, ISO 10993 - 5, test de Cytotoxicité;

Guide de l'industrie: principes directeurs du Centre chinois d'examen des cosmétiques pour l'évaluation des allégations d'efficacité des cosmétiques (édition 2021).

Services d'inspection personnalisés

Support technique full Chain pour différents types de cosmétiques:

Criblage des matières premières: pré - tamisage actif in vitro d'extraits de plantes, de triontines et d'autres ingrédients efficaces, raccourcissant le cycle de recherche et de développement;

Optimisation de la formulation: évaluation de l’impact des conservateurs, des essences sur l’activité de synthèse du collagène, optimisation du Protocole de recombinaison;

Vérification de la stabilité: 28 jours de stockage à 4 ° C, 25 ° C, 40 ° C, suivi de l'impact de la dégradation du principe actif sur l'efficacité;

Services à valeur ajoutée de données: fournit une lecture approfondie des données telles que l'analyse de la voie génétique col1a1, le calcul de l'ingrédient actif IC50 / EC50, etc.

Applications industrielles et cas typiques

Un certain sérum anti - âge a été validé par ce système de test: 48 heures après l'intervention du Groupe de concentration de 1%, la sécrétion de Col1 par les fibroblastes a augmenté de 42,3% (p < 0,01) par rapport au témoin vierge, l'expression de l'ARNm col1a1 a été régulée à la hausse de 2,1 fois et la survie cellulaire a atteint 91,7%. Les données soutiennent avec succès son efficacité pour « promouvoir la synthèse du collagène» et le rapport de test pertinent a été approuvé par le Bureau national des médicaments Jian comme base de dépôt. La pratique montre que les tests de synthèse de collagène in vitro normalisés peuvent remplacer efficacement les expériences animales traditionnelles, tout en garantissant la précision des tests, réduisant considérablement les coûts de R & D et les controverses éthiques, fournissant un support technique scientifiquement fiable pour l'évaluation de l'efficacité cosmétique.