Détection de l'efficacité anti - inflammatoire in vitro des cosmétiques

Détection de l'efficacité anti - inflammatoire in vitro des cosmétiques

Principe de détection et construction de modèles expérimentaux

La détection de l'efficacité anti - inflammatoire in vitro cosmétique repose sur un modèle d'inflammation macrophagique induite par les lipopolysaccharides (LPS) qui évalue l'effet inhibiteur des sujets sur la libération de facteurs inflammatoires en simulant les processus physiopathologiques de la réponse inflammatoire cutanée. L'expérience a utilisé comme cellule modèle le macrophage mononucléé de souris RAW 264.7, qui, stimulé par le LPS, active la voie de signalisation NF - κb, sécrète en grande quantité des médiateurs inflammatoires tels que l'oxyde nitrique (No), l'interleukine - 6 (il - 6) et le facteur de nécrose tumorale Alpha (TNF - alpha), dont les niveaux de libération sont positivement corrélés au degré d'inflammation.

Paramètres clés de la construction du modèle:

Densité d'inoculation cellulaire: 5 x 10⁴ cellules / puits (plaque 96 puits)

Concentration de stimulation LPS: 1 μg / ML (Sigma Aldrich l2630)

Temps de traitement des sujets: stimulation LPS combinée 24h après prétraitement 2h

Contrôle positif: dessaimethasone (1 µmol / L, inhibition ≥ 80%)

L'expérience doit définir cinq gradients de concentration (0,01% ~ 1%) et un témoin vierge pour vérifier la viabilité cellulaire > 80% par la méthode MTT, en veillant à ce que les résultats des tests ne soient pas perturbés par la Cytotoxicité.

Indicateurs de détection de base et validation méthodologique

Détermination des rejets d'oxyde nitrique (No)

La teneur en nitrites des métabolites du No dans les surnageants cellulaires a été quantitativement détectée par la méthode de chromogénèse des réactifs de griess (Sigma - Aldrich g4410). Le processus de détection comprend:

Prétraitement de l'échantillon: prélever 50 µl de surnageant cellulaire mélangé à un volume égal de réactif griess

Conditions d'incubation: 37 ° C réaction à l'abri de la lumière 15min

Instrument de détection: étalon enzymatique (thermo multiskan FC) 540nm longueur d'onde détermination de l'Absorbance

Méthode de calcul: extrapolation de la concentration de No à partir de la courbe standard du sous - acide de sodium (0 - 100 μmol / l), taux d'inhibition de l'inflammation = (moyenne du Groupe modèle - moyenne du Groupe testé) / (moyenne du Groupe modèle - moyenne du groupe vide) × 100%

Exigences de vérification méthodologique: courbe standard r² > 0,99. Précision intrajournalière RSD < 5%, taux de récupération 90% ~ 110%.

Détection des niveaux de facteur inflammatoire (il - 6 / TNF - alpha)

La méthode ELISA sandwich à double anticorps (kit R & D Systems) est utilisée avec les paramètres spécifiques suivants:

Plage de détection de l'il - 6: 7,8 ~ 500pg / ML, limite de détection maximale de 3,9 pg / ml

Plage de détection TNF - alpha: 15,6 ~ 1000pg / ML, limite de détection maximale de 7,8 pg / ml

Étapes opératoires: dilution de l'échantillon → incubation Additive → lavage de la plaque → fixation de l'enzyme Scale - anti → rendu des couleurs (substrat TMB) → arrêt de la réaction (2 mol / l h₂so₄) → lecture de 450 nm

Exigences en matière de données: les taux d'il - 6 / TNF - alpha ont diminué de ≥ 30% dans le Groupe testé par rapport au Groupe modèle et la différence était statistiquement significative (test T d'échantillon indépendant, p<0.05)

Base standard et système de contrôle qualité

Tout au long de l'essai suit strictement OCDE TG 442e (2018) Méthode de détection in vitro de l'irritation cutanée / corrosive et GB / t 35892 - 2018 méthode de test d'irritation in vitro cosmétique modèle de peau 3D. Les principales mesures de contrôle de la qualité comprennent:

Certification de lignée cellulaire: utilisation de cellules RAW 264.7 (ATCC TIB - 71) identifiées par Str avec un nombre de passages contrôlé à moins de 20 générations

Traçabilité des réactifs: activité endotoxine du LPS ≥ 1 × 10 ⁶ eu / mg, coefficient de variation intra - lot du kit ELISA < 10%

Contrôle de l'environnement: incubateur co₂ (37 ℃ ± 0,5 ℃, 5% co₂), banc ultra - net (classe ISO 5)

Validité des données: 3 pores par concentration, expérience répétée 3 fois, coefficient de variation intragroupe < 15%

Processus de détection et critères de décision des résultats

Processus expérimental complet

Préparation cellulaire: réanimation de cellules RAW 264.7, culture par passage avec du milieu dmem contenant 10% de sérum de veau foetal

Traitement du sujet: dilution de l'échantillon cosmétique avec du milieu de culture à une concentration déterminée, bactéricide sur membrane filtrante de 0,22 µm

Induction de l'inflammation: ajout de LPS (concentration finale 1 µg / ML) stimulé pendant 24h, collecte du surnageant cellulaire

Détection d'indicateurs: détermination synchrone de No (méthode griess) et il - 6 / TNF - alpha (méthode ELISA)

Analyse des données: analyse statistique avec graphpad Prism 9.0, calcul de la valeur ic₅₀

Critères de décision des résultats

Remarque: il a été décidé que l'efficacité forte doit satisfaire simultanément à un taux d'inhibition de No ≥ 50% et à un taux d'inhibition d'il - 6 / TNF - alpha ≥ 40%

Capacité technique des organismes de détection

Le laboratoire d’essais sinocentriques est accrédité par le CNAS (certificat n° CNAS l22006) et dispose d’une plate - forme technologique bien établie pour les tests anti - inflammatoires in vitro, comprenant:

Système de détection multifactorielle: luminex xmap 200 (peut détecter 10 Facteurs inflammatoires simultanément)

Imageur à haute connotation: PerkinElmer operetta CLS (analyse de la morphologie cellulaire)

Poste de travail automatisé: Beckman biomek 4000 (traitement pré - échantillon)

Le laboratoire a terminé le projet de test anti - inflammatoire cosmétique de près de 3 ans avec plus de 500 lots couvrant les formes posologiques telles que les crèmes, les sérums, les masques, etc., avec un taux de réussite des données de 92,3%. Les cas typiques montrent qu'un certain sérum apaisant contenant de l'extrait d'Amarante a un taux d'inhibition de No de 62,7% à une concentration de 0,5% et un taux d'inhibition de l'il - 6 de 58,3%, tous supérieurs à la moyenne de l'industrie (taux d'inhibition de No de 41,2%).

Scénarios d'application et valeur de l'industrie

Le test anti - inflammatoire in vitro est principalement appliqué à la vérification de l'efficacité des cosmétiques de la classe de réparation musculaire sensible, de la classe anti - pox et de la classe de réparation post - solaire et peut fournir aux entreprises un soutien technique pour:

Optimisation de la formule: criblage de la quantité maximale de Jia ajoutée d'ingrédients actifs anti - inflammatoires (p. ex. asiaticoside, érythromyllol)

Conformité déclarée: répond aux exigences de détection de l'efficacité "apaisante" dans le Cosmetic Efficiency Claims assessment specification

Concurrence sur le marché: amélioration de la compétitivité des produits grâce à des données de détection tierces, par exemple, une marque internationale augmente la prime de produit de 20% grâce à cette détection

Avec l'augmentation des exigences des consommateurs en matière de sécurité des produits cosmétiques, le test anti - inflammatoire in vitro est devenu un élément central de l'évaluation de l'efficacité. Le laboratoire recommande aux entreprises d'introduire ce test au stade du développement du produit, en combinaison avec le test de patch humain pour former une chaîne complète de preuves, à la fois pour assurer la conformité du produit et renforcer la confiance du marché.