Milieu spécialisé pour cellules musculaires lisses aortiques thoraciques primaires de rat

Points opérationnels:

Étapes de culture cellulaire:

Préparation du milieu de culture et des conditions de congélation:

1) Préparation du milieu dmem - H (ajout de NaHCO 3 1,5 g / l), 90%; Sérum de veau foetal, 10%. Le milieu de suspension peut également être choisi selon les besoins expérimentaux pour permettre aux cellules 293t de croître en suspension.

2) conditions de culture: phase gazeuse: air, 95%; CO2, 5%. Température: 37 degrés Celsius, l'humidité de l'incubateur est de 70% - 80%.

3) lyophilisat: milieu de culture à 90%, DMSO à 10%, maintenant adapté. Stockage d'azote liquide.

II. Traitement cellulaire:

1) réanimer les cellules: décongeler le lyseur contenant 1 ml de suspension cellulaire en agitant rapidement dans un bain - Marie à 37 ° C, ajouter 4 ml de milieu de culture et bien mélanger. Centrifuger 4 min à 1000 RPM, éliminer le surnageant et bien souffler après addition de 1 - 2 ml de milieu. Toutes les suspensions cellulaires sont ensuite ajoutées au flacon de culture pour une nuit de culture (ou la suspension cellulaire est ajoutée à une boîte de 10 cm, environ 8 ml de milieu sont ajoutés pour une nuit de culture). Changez de liquide le lendemain et vérifiez la densité cellulaire.

2) Passage cellulaire: si la densité cellulaire atteint 80% - 90%, la culture de passage peut être effectuée.

Pour les cellules adhérentes, le passage peut se référer aux méthodes suivantes:

1. Jeter le surnageant de culture et laver les cellules 1 - 2 fois avec du PBS sans ions calcium et magnésium.

Ajouter 2 ml de digestat (0,25% Trypsin - 0,53 mm EDTA) dans un flacon de culture, placer dans un incubateur à 37 ° C pour la digestion pendant 1 - 2 minutes, puis observer la digestion des cellules sous un microscope, si la plupart des cellules deviennent rondes et tombent, rapidement revenir à la table d'opération, tapoter quelques flacons de culture après avoir ajouté une petite quantité de milieu pour terminer la digestion.

3. Appuyez sur 6 - 8 ml / flacon pour compléter le milieu de culture, bien agiter et bien aspirer, centrifuger à 1000 RPM pendant 4 minutes, retirer le surnageant, ajouter 1 - 2 ml de milieu de culture et bien souffler.

4. Distribuer la suspension cellulaire dans de nouvelles boîtes contenant 8 ml de milieu ou dans des flacons dans un rapport de 1: 2 à 1: 5.

3) lyophilisation cellulaire: la lyophilisation cellulaire peut être effectuée lorsque la croissance cellulaire est en bon état. Lorsque les cellules collées sont congelées, une petite quantité est ajoutée après l'abandon du milieu de culture, après que les cellules deviennent rondes et tombent, environ 1 ml de milieu contenant du sérum est ajouté au lyophilisateur, puis 10% de DMSO est ajouté.

Méthode de Cryoconservation des cellules?

Méthode de Cryoconservation I: le tube de congélation est placé à 4 ℃ 30 ~ 60 minutes → (- 20 ℃ 30 minutes *) → - 80 ℃ 16 ~ 18 heures (ou toute la nuit) → réservoir d'azote liquide VaporPhase stockage à long terme.

Méthode de Cryoconservation II: le tube de congélation est placé dans le refroidisseur Programmable du programme défini, chaque minute tombe de 1 - 3 ℃ à - 80 ℃, puis dans le réservoir d'azote liquide Vapor phase de stockage à long terme. - 20 ℃ ne peut pas être plus d'une heure pour empêcher les cristaux de glace trop gros, provoquant la mort massive des cellules, ou sauter cette étape directement dans le réfrigérateur à - 80 ℃, mais la survie est légèrement réduite.