FITC - kit d'apoptose Annexin V / pi

FITC - kit d'apoptose Annexin V / pi

Numéro d'expédition du produit:F6012L

Spécifications du produit:100T

Conditions de stockage:

4℃Réfrigérer à l'abri de la lumière, ne pas congeler.Date d'expiration voir emballage extérieur- Oui.

Caractéristiques spectrales:

FITC-Annexine V: Ex/Em = 494/518 nm

PI: Ex/Em = 535/617 nm (avec ADN)

Introduction du produit:

FITC-Annexine V/PILes kits d'apoptose offrent un moyen rapide et facile de marquer les cellules apoptotiques précoces (en vert) et les cellules nécrotiques ou apoptotiques tardives(rouge) détecte le niveau d'apoptose. Les produits peuvent être détectés à l'aide d'un cytomètre de flux ou d'autres dispositifs de détection par fluorescence.

Annexe V(annexine- V), est un poids moléculaire qui est35-36KDDeCa2 +Protéines Phospholipides - liantes dépendantes, qui peuvent dépendre des phosphatidyles (PS), la liaison sélective.Phosphatidyle (PS), principalement distribués à l'intérieur de la membrane cellulaire, c'est - à - dire du côté adjacent au plasma cellulaire. Au début de l'apoptose, différents types de cellules mettent des PhospholipidesL'acyle est épitaxié à la surface de la cellule et exposé à l'environnement extracellulaire. À ce stade, utilisez une sonde fluorescente verteFITCMarquéAnnexe V, à savoirFITC - Annexe V，Phosphatidyle avec valvulation (PS), en combinaison avec la cytométrie de flux disponible ou la microscopie à fluorescence détecte directement l'inversion des phosphatidyles, une caractéristique importante de l'apoptose cellulaireSigne. Pour les cellules nécrotiques ou apoptotiques tardives, l'intégrité cellulaire ayant été détruite,FITC - Annexe VPuis peut entrer dans le cytosol avec ceux qui sont à l'intérieur de la couche de PhospholipidesPSSe lie, donnant ainsi également aux cellules nécrotiques une Fluorescence verte.

Iodure de Propidium (Iodure de propidium, PI) est une sorte deADNCombiné avec un colorant, il peut colorer la finesse des cellules nécrotiques ou des cellules qui perdent l'intégrité de la membrane cellulaire à un stade avancé de l'ApoptoseNoyau cellulaire.PIPeut être faite par488、532 Ou546 nmExcitation Laser, présentant une Fluorescence rouge.

Mode d'emploi :

1. Conception expérimentale:

Tube blanc: cellules de contrôle négatives, sans additionFITC-Annexine V/PI. pour réguler la tension.

Tube mono - infecté: cellules de contrôle positives, plus seulementFITC-Annexe V/Ajouter seulementPI. pour ajuster la compensation.

Tube de détection: cellules traitées, plusFITC-Annexine V/PI. après ajustement de la compensation de tension avec des tubes vierges et des tubes teints simples, les données de flux requises sont obtenues.

2. Recueillir les cellules:

(1) pour les cellules en suspension:

a.Après avoir effectué la stimulation apoptotique,1000 tr/minCentrifugation5 minutesDéfausser, recueillir des cellules, utiliserPBSSuspendez doucement les cellules et comptez. Note:PBSLe resurfaçage ne peut pas être omis,PBSLe processus de remise en suspension joue également le rôle de laver les cellules, ce qui peut garantir le suiviFITC-Annexe VL'Union.

b.取5×104 - 1×105Une cellule suspendue,1000 tr/minCentrifugation5 minutesAbandonner, rejoindre100 µL 1 x Annexine VLe tampon de liaison suspend doucement les cellules.

c.Adhérer5 µL FITC-Annexine VMélanger doucement.

d.Adhérer5 µL PILiquide de teinture, mélanger doucement.

e.Température ambiante(20-25ºC)Incubation à l'abri de la lumière10 à 15 minutes. peut être protégé de la lumière avec du papier d'aluminium. Les cellules peuvent être remises en suspension pendant l'incubation2 - 3Secondaire pour améliorer l'effet de teinture.

(2) pour les cellules plaquées:

a.Aspirer le liquide de culture cellulaire à l'intérieur d'un tube de centrifugation approprié,PBSLavez les cellules tapissées une fois, ajoutez la bonne quantité de digestat cellulaire(Ne contient pasEDTA)Cellules digestives. L'incubation à température ambiante jusqu'à un soufflage léger peut permettre aux cellules plaquées de souffler vers le bas, en aspirant le suc digestif cellulaire. Digestion excessive à éviter. Remarque: pour les cellules plaquées, l'étape de digestion est cruciale. Si le temps de digestion est trop court, les cellules ont besoin de souffler fort pour tomber, ce qui peut facilement causer des dommages à la membrane cellulaire, ce qui entraîne un faux positif pour la nécrose cellulaire; Si le temps de digestion est trop long, il est également susceptible de causer des dommages à la membrane cellulaire et il y a un faux positif pour la nécrose cellulaire, qui peut même affecter la membrane cellulaire sur les phosphatidyles avecFITC-Annexe VLa liaison interfère ainsi avec la détection de l'apoptose.

b.Ajouter le liquide de culture cellulaire recueilli à l'étape précédente, souffler doucement les cellules et les transférer à l'intérieur du tube de centrifugation,1000 tr/minCentrifugation5 minutesDéfausser, recueillir des cellules, utiliserPBSSuspendez doucement les cellules et comptez. Remarque: l'ajout du liquide de culture cellulaire à l'étape précédente est très important, d'une part, pour collecter les cellules déjà en suspension qui ont subi l'apoptose ou la nécrose, et d'autre part, le sérum dans le liquide de culture cellulaire peut efficacement inhiber ou neutraliser ce qui reste. Les résidus digèrent et dégradent les ajouts ultérieursFITC-Annexe VProvoque l'échec de la coloration.

c.取5×104 - 1×105Une cellule suspendue,1000 tr/minCentrifugation5 minutesAbandonner, rejoindre100 µL 1 x Annexine VLe tampon de liaison suspend doucement les cellules.

d.Adhérer5 µL FITC-Annexine VMélanger doucement.

e.Adhérer5 µL PILiquide de teinture, mélanger doucement.

f.Température ambiante(20-25ºC)Incubation à l'abri de la lumière10 à 15 minutes. peut être protégé de la lumière avec du papier d'aluminium. Les cellules peuvent être remises en suspension pendant l'incubation2 - 3Secondaire pour améliorer l'effet de teinture.

3. Analyse des résultats:

(1) Détection cytométrique en flux:

A. une fois l'incubation terminée, les cellules peuvent être remises en suspension avec 400 µl de tampon de liaison à l'annexine V directement ajouté pour être immédiatement détectées, FITC - annexine V excité par un laser à 488 nm avec un spectre d'émission de fluorescence de détection à 530 nm (canal FITC) et un spectre d'émission de canal Pi à environ 617 nm.

B. sur le diagramme de dispersion du cytomètre en flux bivariable, les cellules vivantes sont indiquées dans le quadrant inférieur gauche sous la forme (FITC - Annexe V - / PI -); Le quadrant inférieur droit pour les cellules apoptotiques précoces est (fitannexin V + / PI -); Le quadrant supérieur droit est composé de cellules nécrotiques et apoptotiques tardives, qui sont (FITC - Annexin V + / pi +); Le quadrant supérieur gauche montre les cellules nucléaires nues qui sont (FITC - Annexin V - / pi +).

(2) détection par microscopie à fluorescence:

A. centrifuger à 1000 RPM pendant 5 min, recueillir les cellules et les remettre en suspension doucement avec 400 µl de tampon de liaison 1x annexine v. Les cellules sont placées sous observation au microscope à fluorescence après avoir été déplacées dans une plaque de 96 puits pour un moment de décantation ou après avoir subi un frottis cellulaire.

B. FITC - Annexe V est disponible avec des filtres FITC, Pi avec des filtres Cy3 ou Texas.

Précautions:

1. S'il vous plaît centrifuger momentanément le produit au fond du tube avant l'utilisation, puis effectuer des expériences ultérieures.

2. Pour réduire le processus d'apoptose, le processus d'incubation peut être opéré sur glace, mais la durée d'incubation est prolongée au moins jusqu'à30 minutes- Oui.

3. Comme l'apoptose est un processus rapide, il est recommandé que l'échantillon après la coloration1 heureAnalyse interne.

4. Pour les cellules plaquées, la digestion est une étape clé. Si les cellules murales induisent l'apoptose s'il y a des cellules flottantes, les cellules flottantes et les cellules murales doivent être collectées après coloration combinée. Manipulez avec soin lors de la manipulation des cellules plaquées, essayez d'éviter les dommages causés par l'homme aux cellules. Temps de digestion trop court, les cellules ont besoin de souffler fort pour tomber, facilement causer des dommages à la membrane cellulaire,PIIngestion excessive; Temps de digestion trop long, la membrane cellulaire est également susceptible de causer des dommages, et peut même affecter la membrane cellulaire sur les phosphatidyles avecFITC-Annexe VLa jonction. Après la digestion sera recouvert du fond de la plaque de puits, tout en agitant doucement en plein contact avec les cellules, puis verser la majeure partie, en utilisant la petite quantité restante pour digérer pendant un certain temps, à agrandir les espaces intercellulaires, le fond de la bouteille en forme de tache florale peut se terminer. Essayez de ne pas utiliser dans les sucs digestifsEDTA,EDTAAura un impactAnnexe VAvecPSL'Union.

5. Après la digestion des cellules plaquées, il est recommandé de restaurer environ dans les conditions de culture et le milieu de culture30 minutesPost - teinture pour éviter les faux positifs.

6. Pour éviter la perte de cellules lors du lavage des cellules, lors de la succion peut être utilisé avec de grandesConseilsPetit sur le couvre - têteConseilsSucer la tête.

7. La concentration d'utilisation du colorant est déterminée par des exigences expérimentales spécifiques.

8. Les colorants fluorescents ont tous des problèmes de trempe, essayez d'éviter la lumière pendant la conservation et l'utilisation pour ralentir la trempe fluorescente.

9. Pour votre sécurité et votre santé, portez une combinaison expérimentale et manipulez - la avec des gants jetables.