3T3 - L1 (fibroblastes embryonnaires de souris)

Méthodes de préservation cellulaire:

(i) congélation des cellules

1. Formuler un liquide de lyophilisation contenant 10% de DMSO ou de glycérine, 10 à 20% de sérum de veau;

2. Prenez les cellules de la phase de croissance logarithmique, retirez l'ancien liquide de culture et lavez - le avec du PBS.

3. Enlever le PBS et ajouter la bonne quantité (couvrant la surface de la boîte de pétri) pour digérer la monocouche de cellules cultivées;

4. Centrifuger 1000rpm, 5min;

5. Enlever, ajouter la bonne quantité de lyophilisat formulé, souffler doucement avec une paille pour homogénéiser les cellules, compter, ajuster la densité finale des cellules dans le lyophilisat est de 5 × 106 / ML ~ 1 × 107 / ML;

6. Fractionner les cellules dans un tube de congélation, 1 ~ 1,5 ml par tube;

7. Indiquer le nom de la cellule sur le lyophilisateur, le temps de lyophilisation et l'opérateur;

8. Stockage de congélation: la procédure de stockage de congélation standard est le taux de refroidissement - 1 ~ - 2 ℃ / min; Lorsque la température est inférieure à - 25 ℃, elle peut être augmentée à - 5 ℃ ~ - 10 ℃ / min; À - 100 ℃, il peut être rapidement immergé dans l'azote liquide. Vous pouvez également placer le cryosepteur avec les cellules dans un réfrigérateur à - 20 ℃ pendant 2 heures, puis dans un réfrigérateur à - 70 ℃ pendant la nuit, retirer le cryosepteur et le déplacer à l'intérieur du récipient d'azote liquide.

Informations sur le produit:

Présentation des marchandises:

Étapes opérationnelles:

1), changer la moitié ou la quantité complète de milieu 24 - 48 heures avant la congélation, de sorte que les cellules sont dans une phase de croissance exponentielle.

2), formulez la solution cryoconservée (formulée avant utilisation): Prenez un autre tube de centrifugation, ajoutez le milieu de culture, le sérum, ajoutez goutte à goutte le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 20%, c'est - à - dire faites un double lyophilisat, mettez - le à température ambiante pour être utilisé.

3), centrifuger pour recueillir les cellules cultivées, les remettre en suspension avec du milieu de culture avec du sérum, prendre une petite quantité de suspension cellulaire (environ 0. 1 mL) compter la concentration cellulaire et la survie avant le gel.

4), prenez la même quantité de lyophilisat que la suspension cellulaire, ajoutez lentement la suspension cellulaire goutte à goutte et Agitez le tube pour faire une suspension de lyophilisat cellulaire (DMSO après concentration de 5 à 10%), de sorte que la concentration cellulaire est de 1 à 5 × 106 cells / ML, bien mélangé, divisé dans un tube de Cryoconservation étiqueté, 1 à 2 ml / Vial, et prenez une petite quantité de suspension cellulaire pour la détection de la contamination. Après une fermeture serrée, indiquez le nom de la cellule, l'algèbre, la date. La congélation est ensuite effectuée.

Précautions:

1) pour la Cryoconservation des cellules doivent être dans un bon état de croissance et de survie élevée, environ 80 à 90% de densité. Avant la congélation, les cellules doivent être testées pour la production d'anticorps un ou deux jours avant la Cryoconservation.

2), les cellules dans l'azote liquide peuvent être congelées pendant une longue période sans affecter la viabilité cellulaire; Il se conserve plusieurs mois à - 70 degrés.

3), faites attention à la qualité du cryoprotecteur. Le DMSO doit être de grade réactif, stérile et incolore (à 0. 22micron fglp telflon filtre ou acheter directement des produits stériles tels que Sigma D - 2650) dans un petit volume de 5 à 10 ml, 4 ℃ protégé de la lumière, ne pas décongeler plusieurs fois. Le glycérol doit également être classé réactif et conservé à l'abri de la lumière après stérilisation à la vapeur. Utilisé dans l'année suivant l'ouverture, car il peut être toxique pour les cellules après un stockage prolongé. La préparation préalable d'un double lyophilisat dans cette méthode permet d'éviter les dommages aux cellules par la chaleur dégagée par l'addition directe de DMSO. L'ajout lent goutte à goutte de la suspension cellulaire permet aux cellules de s'adapter progressivement à l'hyperosmolarité, ce qui peut réduire les dommages cellulaires. Le DMSO, qui peut provoquer la différenciation d'une partie des souches cellulaires leucémiques, peut être remplacé par de la glycérine à 10%.

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