Afdye 555 NHS Ester coloration cellulaire

AFDye 555 NHS ester

(Équivalent de l'ester NHS Alexa Fluor 555)

Informations sur le produit

Description du produit

Afdye 555 est un colorant soluble dans l'eau et stable à la lumière avec un rendement très élevé de quanta lumineux. L'afdye 555 est un colorant fluorescent orange qui peut être excité à l'aide de raies laser 488 nm ou 532 nm. Est une alternative au Cy3 ou à la tétraméthylrhodamine et présente une photostabilité supérieure à celle du Cy3 dans les cellules vivantes et fixes. Très bien toléré dans la gamme de pH 4 - 10.

Afdye555 NHS ester (Equivalent toalexa fluor 555 NHS ester) est un colorant Fluorescent orangé réactif aux Amines qui marque généralement des protéines ou des anticorps, des Polypeptides, des oligonucléotides modifiés par des amines et d'autres biomolécules contenant des Amines. Ce marquage est généralement efficace dans la gamme de pH 7 - 9 Zui, formant une liaison amide stable et covalente.

Caractéristiques du produit

Conservation et méthodes de transport

Conservation: - 20°C Conservation sèche à l'abri de la lumière, valable 2 ans.

Transport: transport de sacs de glace.

Précautions

1) les colorants fluorescents ont tous des problèmes de trempe, essayez de prêter attention à l'évitement de la lumière pour ralentir la trempe fluorescente.

2) afdye NHS Ester série de colorants, bien qu'il ait une certaine solubilité dans l'eau, mais il est fortement recommandé de formuler la solution mère avec DMSO, DMF dissolution, puis procéder à des expériences de marquage ultérieures. En effet, dans les systèmes hydrosolubles, ces groupes réactifs sont très facilement hydrolysés pour donner des formes acides libres non réactives.

3) pour votre sécurité et votre santé, Veuillez porter des vêtements expérimentaux et utiliser des gants jetables.

I. Étapes de coloration (en prenant comme exemple le marquage des immunoglobulines IgG)

Presque toutes les protéines ou Polypeptides peuvent être marqués avec des réactifs de réaction aux Amines (sondes). Voici les étapes de marquage optimisées pour les anticorps IgG, l'utilisateur peut agrandir ou réduire le système réactionnel en fonction de sa propre quantité de protéines, mais pour obtenir un résultat de coloration idéal, la concentration en protéines ne doit pas être inférieure à 2 mg / ML. En raison de l'ordre de base des Amines contenues dans différentes protéines (Polypeptides), la position de la surface des Amines est très différente, il est recommandé aux utilisateurs, lors de l'expérience initiale, d'établir trois groupes différents de réactifs aminés: le rapport molaire de la protéine Pour cribler le rapport molaire qui peut atteindre l'efficacité du marquage zuijia.

1.1 dissoudre suffisamment ~ 10 mg de protéine dans 1 ml de tampon carbosuane hydrogénosodique 0,1 m.

Note ①: la concentration en protéines est généralement de 5 à 20 mg / ML et le succès du couplage dépend fortement de la concentration en protéines. Lorsque la concentration est inférieure à 2 mg / ML, cela peut sérieusement affecter l'efficacité du marquage.

Note ②: le système de marquage doit éviter toute contamination par des substrats aminés tels que Tris, Glycine, sels d'ammonium, ou d'autres protéines stabilisantes telles que BSA, etc., telles que la solution protéique à marquer contenant les substances ci - dessus, il doit être Dialysé contre du tampon phosphate (PBS) à 10 - 20 mm, puis ajouter 0,1 ml de tampon bicarbonate 1 m (pH 8,3 - 9,0) par ml de solution protéique au pH souhaité.

Note ③: de faibles concentrations d'azinate de sodium (& lt; 3 mm) ou de thiomersal (& lt; 1 mm) présentes dans la solution d'anticorps n'interfèrent pas avec la réaction de marquage.

1.2 dissoudre le réactif Amine (sonde) (par exemple: afdye555 NHS ester) à 10 mg / ML avec du DMF ou du DMSO anhydre de haute qualité.

Remarque: la solution aqueuse de l'ester afdye 488 NHS doit être prête à l'emploi et ne doit pas être conservée car elle peut être hydrolysée en acide libre inactif en solution aqueuse. Le liquide de stockage DMSO de l'ester afdye 488 NHS peut être conservé à ≤ - 20 ° C et il est recommandé de l'utiliser dans les 2 semaines.

1.3 ajouter lentement 50 à 100 µl de réactif Amine (sonde) Tout en agitant ou en faisant tourner la solution protéique.

Remarque ①: la quantité de réactif Amine (sonde) ajoutée est de 0,5 à 1 mg, au total, environ 1 / 4 - 1 / 3 du réactif amine sera couplé à la protéine. Différentes protéines et réactifs de marquage ont des effets de marquage différents, veuillez optimiser les proportions des deux au cas par cas.

1.4 incuber 1 H (ou plus) à température ambiante en agitant lentement à l'abri de la lumière.

1,5 [facultatif] la réaction est terminée par l'addition de 0,1 ml d'hydroxylamine 1,5 m fraîchement formulée (pH 8,5), le système contenant de l'hydroxylamine étant incubé à température ambiante pendant 1 h.

1.6 purification: Choisissez un moyen approprié (par exemple, dialyse, colonne P - 30 ou colonne Pd - 10) pour purifier le produit marqué, éliminer les ions sels ou les réactifs de réaction amine qui n'ont pas réagi.

1.7 stockage: les protéines marquées sont conservées à l'abri de la lumière à 2 - 8 ° c. Si la concentration du coupleur protéique purifié est < 1 mg / ML, ajouter 1 - 10 mg / ml de BSA ou d'autres protéines stables. En présence de 2 mm d'azinate de sodium, 2 - 8 ° C peuvent être conservés pendant plusieurs mois. Pour conserver plus longtemps, il est nécessaire de conserver à l'abri de la lumière à - 20 ℃ après le chargement et d'éviter le gel et la dégel répétés.

II. Calculer la proportion de marqueurs (valeur F / p)

Pour la plupart des anticorps tels que les immunoglobulines IgG, un coefficient d'absorption molaire de la lumière de 203 000 et une valeur F / P comprise entre 4 et 9 sont les plus appropriés.
2.1calcul de la valeur F / P de la protéine marquée afdye555:
1) diluer la quantité de la petite protéine de couplage purifiée avec un multiple précis de PBS, déterminer l'absorption de la lumière à 280 nm et 555 nm dans une boîte de couleur de 1 cm;
2) Calculer la concentration de protéine dans l'échantillon: Concentration molaire de protéine = (A280 - (a555 × 0,08)) × multiple de dilution / 203000
3) Calculer la proportion de marqueurs: mole de colorant lié par mole de protéine = a555 × multiple de dilution / (150 000 × mole de protéine)

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– Écrit / édité par V. shallan [Copyright mkbio懋kang]

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