Clonage et analyse de l'expression de cellules électrosensibles d'Agrobacterium

Cellule électrocompétente EHA105(pSoup)

Cellules électroréceptrices d'Agrobacterium

Étiquette du produit:

La souche eha105; Cellules d'Agrobacterium sensibilis; Rifampicine (RIF) rifupine; Kanamycin (kan) kanameicine; EHA101； LBA4404； GV3101； AGL1； Recherche sur les plantes génétiquement modifiées;

Commande de produits:Des problèmes techniques plus importants avec l'emballage ou le produit,

Description du produit:

La souche eha105 a été modifiée à partir de la souche eha101 avec un fond chromosomique c58 et un gène nucléaire contenant une étiquette de criblage - rif du gène de résistance à la rifupine, afin de faciliter les opérations de transformation, cette souche porte un plasmide ti de type base - succinique sans fonction de transport propre, peha105 (ptibo542dt - DNA), qui contient le gène vir (le gène vir est un élément essentiel pour l'insertion de l'ADN - t dans le génome de la plante, le plasmide peha105 (ptibo542dt - DNA) a sa propre fonction de transfert d'ADN - t qui, bien que détruite, peut aider à transférer en douceur l'ADN - t du vecteur binaire transféré). Transfert du plasmide d'aide: psoup dans la souche eha105, soit: la souche eha105 (psoup) peut aider à la réplication des plasmides de la série pgreen, 62sk, pgs2 chez Agrobacterium tout en conférant à cette souche une résistance à la tétracycline (tetr), adaptée à la manipulation transgénique de plantes telles que le riz, Le tabac, etc.

Les cellules électrosensibles eha105 (psoup) fournies par Notre société (懋kang bio) sont fabriquées par un procédé spécial et sont particulièrement adaptées à la transformation de gros plasmides. Le génotype est c58 (rifr) Ti peha105 (psoup) (ptibo542dt - DNA) succinamopine (psoup - tetr) avec une efficacité de transformation > 105 UFC / µg d'ADN détectée par le plasmide pgs2.

Composants du produit:

Conditions de conservation et de transport:

Conservation: - 80 ℃ conservation, valable 1 an.

Transport: transport de glace sèche.

Précautions

1) Les cellules réceptrices doivent être conservées à - 80 ° C et ne peuvent pas être congelées et fondues à plusieurs reprises et placées trop longtemps pour ne pas réduire l'efficacité de transformation des cellules réceptrices.

2) l'ensemble de l'opération de transformation, strictement selon les exigences de température et de stérilité correspondantes.

3) Le volume ajouté au plasmide ne doit pas dépasser 1 / 10 du volume de l'état sensible. L'impureté des plasmides ou la présence de contamination par des matières organiques telles que l'éthanol peuvent entraîner une forte baisse de l'efficacité de conversion. Le plasmide double et l'efficacité de transformation diminue d'un ordre de grandeur.

4) pour assurer l'efficacité de conversion élevée de Zui, l'ensemble du processus d'opération devrait être aussi doux que possible et maintenu à basse température.

5) La conversion de concentrations élevées de plasmides peut réduire la quantité finale de plaque en conséquence.

6) Lorsque la densité de clones sur la plaque est trop élevée, la croissance des clones ralentit et les colonies deviennent plus petites en raison de carences nutritionnelles. Pour obtenir de grandes colonies, la quantité de plasmide utilisée doit être réduite.

7) Le but de l'ajout de rifupine dans le milieu de culture est d'empêcher la croissance d'hétérobactéries, le dépistage d'Agrobacterium; L'ajout de la chaîne meicine ou de la chondaméine selon la résistance de la souche utilisée empêche la perte du plasmide ti, mais la chaîne meicine n'est pas propice à la manipulation transgénique d'Agrobacterium, la chaîne meicine ou la chondaméine n'est pas prise en compte lors de la culture générale d'Agrobacterium, la probabilité de perte du plasmide ti étant extrêmement faible (largement négligeable)

8) pour votre sécurité et votre santé, Veuillez porter des vêtements expérimentaux et utiliser des gants jetables.

Mode d'emploi

1) sortir la tasse de choc de 0,1 cm et le couvercle de la tasse du liquide de stockage à l'envers sur le papier absorbant propre pendant 5 minutes, pour qu'il égoutte l'humidité, mettre en place 5 minutes pour que l'éthanol soit suffisamment volatilisé et propre, insérer immédiatement dans la glace, compacter la surface de glace, le dessus de la tasse d'électrode de 0,5 cm de la surface de glace pour faciliter le couvercle de la tasse, laisser reposer 5 minutes dans la glace pour le refroidir suffisamment.

2) prenez - 80 ℃ préservé cellules sensibles et insérez - les dans la glace pendant 5 min à fondre.

3) Ajouter 0,01 ~ 1 μg (volume pas plus de 6 μl) d'ADN plasmidique à 50 μl de suspension de cellules réceptrices, frapper le fond du tube avec la main Bo pour le mélanger et l'insérer immédiatement dans la glace. Mélanger les cellules réceptrices avec un pistolet à souffler doucement - le plasmide est rapidement transféré dans une tasse à choc électrique, le couvercle de la tasse est recouvert et le tube vide reste prêt à l'emploi [Note: en raison de l'efficacité plus élevée de la transformation de l'état sensible, di utilise zuihao à la fois pour faire un pré - test pour déterminer la quantité de plasmide de zuijia].

4) démarrez l'électroconvertisseur, paramètre de réglage: C = 25μf, PC = 200 Ohm, V = 2400 V (ce paramètre se réfère à bio - rad, pour une utilisation spécifique, s'il vous plaît se référer à l'étape recommandée de l'électroconvertisseur pour l'opération), placez rapidement la tasse de choc dans l'électroconvertisseur, le choc électrique complète l'insertion rapide dans la glace.

5) Ajouter 700 μl de LB sans antibiotiques et transférer dans un tube vide à l'état sensoriel, incuber à 28 ℃ sous agitation pendant 2 ~ 3H.

6) centrifuger à 6000 RPM pendant 1 min, laisser environ 100 µl pour le surnageant, après quoi souffler doucement la suspension lourde avec un pistolet. Ensuite, les cellules sont ajoutées sur des plaques LB ou yeb contenant l'antibiotique correspondant et étalées uniformément avec un bâton de verre stérile. La température ambiante est positive pendant 10 min, après que le liquide à absorber, les plaques sont inversées et incubées à 28 ° C pendant 2 - 3 jours. [Remarque: lorsque la plaque ne contient que l'antibiotique porteur binaire utilisé pour la transformation, une culture à 28 ° C pendant 48h est suffisante; Lorsque l'antibiotique porteur binaire est ajouté à la plaque, une culture supplémentaire de 10 µg / ml de rifu est nécessaire pendant 48 à 60 h à 28 ° C; lorsque l'antibiotique porteur binaire est ajouté à la plaque, une culture supplémentaire de 20 µg / ml de rifu est nécessaire pendant 60 à 72 h à 28 ° c; l'utilisation de plus de 20 µg / ml de rifu en plaque ou en culture liquide n'est pas recommandée.

7) culture liquide des clones de destination:

J petites quantités de champignons: ajouter 1 ml de milieu liquide LB contenant l'antibiotique correspondant dans un tube à essai perméable à fond rond de 15 ml, ensemencer 1 à 2 colonies uniques à partir de plaques fraîchement cultivées, 30 ° C, 200 tr / min de champignons.

K grand nombre de secousses: moins de 20 ml de milieu liquide LB contenant l'antibiotique correspondant sont ajoutés dans un tricolore respirant de 100 ml, prendre le petit liquide de secousse à raison de 2% pour ramasser les bactéries, 30 ° C, 200 tr / min de secousses 24 - 48 H.

[Note]: pour Agrobacterium (bactéries aérobies), qu'il s'agisse d'une plaque solide ou d'un shaker liquide, il faut beaucoup d'oxygène. La clé du succès du Shaker liquide est de garantir une teneur suffisante en oxygène dissous dans le milieu de culture, qui peut être contrôlée par: J avec un tube à essai respirant ou un flacon triangulaire; K assurer une grande section transversale et une faible épaisseur de la solution nutritive; L antibiotiques avec ou sans antibiotiques, les antibiotiques qui doivent être ajoutés sont utilisés à faible concentration.

Produits associés [série de cellules sensibles]

Annexe 1 formulation de milieu LB solide et liquide

Annexe 2 formulation de milieu yeb solide et liquide

Tableau 3 sommaire de la sensibilité aux antibiotiques des Agrobacterium communs

– Écrit / édité par V. shallan [Copyright mkbio懋kang]

Shanghai 懋kang Biotechnology Co., Ltd. Est un réactif, un instrument et un consommable de laboratoire et un service expérimental impliqués dans la recherche dans le domaine des sciences de la vie et de la biotechnologie, principalement dans la biologie cellulaire, la botanique, la biologie moléculaire, l'immunologie, la biochimie, la protéomique. Biopharmaceutique et réactifs de diagnostic R & D production et d'autres domaines. Notre société adhère à la philosophie d'entreprise de « mettre les gens au premier plan, croire sincèrement et respecter le contrat». Adhérer au principe de la « garantie de qualité» pour fournir des produits de qualité à un large éventail de clients.