Fibroblastes du cerveau humain

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La fibrogenèse du cerveau humain est séparée du tissu cérébral; Le cerveau est divisé en deux hémisphères gauche et droite, le cortex cérébral (matière grise) couvrant la majeure partie de chaque hémisphère cérébral, où se concentrent les cytosomes neuronaux. À l'intérieur se trouve la substance blanche, constituée de fibres nerveuses ou de myéline. Chaque hémisphère a trois faces, c'est - à - dire la face latérale externe (qui occupe environ toute la surface corticale)1 / 3), la face intérieure et la face inférieure (2 / 3 de la surface); La surface hémisphérique a beaucoup de sillons ou de fissures de profondeur variable, des appels de bosse entre les sillons ou les fissures, ils augmentent considérablement la surface du cerveau; Sillons importants sur les côtés externes du cerveau, fentes avec fentes externes du cerveau, fentes occipitales supérieures et sillons centraux. En raison de la séparation des trois clivages, les composants du cortex cérébral sont divisés en quatre grandes parties: le lobe frontal, le Lobe pariétal, le lobe temporal et le Lobe occipital. Les fibroblastes (fibroblast) sont les principaux composants cellulaires du tissu conjonctif lâche, différenciés par les cellules mésenchymateuses de la période embryonnaire; Les fibroblastes sont plus grands, bien profilés, avec une structure aplatie en forme de fuseau ou d'étoile, dont le noyau est régulièrement ovale et le nucléole est grand et prononcé. L'activité fonctionnelle des fibroblastes est vigoureuse, le cytoplasme est faiblement alcalin, a une activité marquée de synthèse et de sécrétion de protéines, dans certaines conditions, il peut réaliser une interconversion avec les fibroblastes; Les fibroblastes jouent un rôle important dans la réparation de différents degrés de dégénérescence cellulaire, de nécrose et de défauts tissulaires. Les fibroblastes cérébraux fraîchement isolés sont ronds, bien réfractifs et en suspension dans le milieu de culture. 30 min de cellules collées, dont une partie commence à dépasser le pseudo - pied, se manifestant par de petites protubérances; Après 6h, les cellules sont essentiellement collées Wan complet, étiré en forme de fuseau, le noyau est clair, la distribution est plus uniforme, dispersée dans la croissance, pas d'agrégation en masse; La croissance cellulaire est rapide, 5 - 7 jours est dans l'état de fusion, les cellules sont étroitement alignées, certains se chevauchent croissance, plat, cytoplasme plus grand, cytoplasme transparent, noyau plus grand, ovale, couleur pâle. Les cellules sont fusionnées et reliées les unes aux autres en mailles; Les cellules sont distribuées à plat en forme de fuseau ou d'étoile de protubérance.
Introduction à la méthode:

Entreprise laboratoire isolé cerveau humain fibrogenèse adoptionYi protéase - collagénase méthode de digestion mixte combinée à la méthode de l'application différentielle, la quantité totale de cellules est d'environ 5 × 10? Cellules / bouteilles.
Détection de qualité:

Entreprise laboratoire isolé fibroblaste du cerveau humainVimentin est identifié par immunofluorescence avec une pureté pouvant atteindre plus de 90% et ne contient pas de VIH - 1, de VHB, de VHC, de mycoplasmes, de bactéries, de levures et de champignons, etc.

Milieu de culture ContientFBS、 Additifs de croissance, Penicillin, streptomycine, etc.

Fréquence de changement de liquide chaque2 - 3 jours pour changer de liquide une fois

Caractéristiques de croissance Appliquer le mur

Forme cellulaire Comme les fibroblastes

Caractéristiques des générations TransmissibleEnviron 5 générations; État dans les 3 générations

Liquide digestif 0,25% protéase Yi

Conditions de culture Phase gazeuse: air,95%； CO2, 5 %

préparation

1. Préparation de l'équipement expérimental: préparer des boîtes de pétri stériles, des flacons de culture, des pipettes, des tubes de centrifugation, des instruments chirurgicaux, etc., et procéder à l'autoclave ou à d'autres traitements de désinfection appropriés.

2. Préparation des réactifs: formulez ou achetez le milieu de culture approprié, les enzymes digestives (par exemple, collagénase, etc.), le sérum de veau foetal, le double anti - réactif et d'autres réactifs, assurez - vous qu'ils sont stériles et dans la période de validité.

3. Préparation des animaux de laboratoire ou des tissus d'origine: selon les besoins de l'expérience, les tissus nécessaires sont obtenus en sélectionnant les animaux appropriés et en effectuant l'anesthésie ou la mise à mort correspondante; Ou obtenez une organisation à partir d'une bibliothèque d'échantillons d'organisation existante.

Matériaux et traitement

1. Extrait: dans des conditions stériles, retirer rapidement le tissu cible, minimiser les dommages aux tissus et éliminer l'excès de graisse, le tissu conjonctif et d'autres tissus non destinés.

2. Lavage: rincez le tissu retiré plusieurs fois avec du PBS stérile prérefroidi pour éliminer le sang et les impuretés.

3. Couper: couper le tissu en petits morceaux d'environ 1 - 2 mm³ pour une digestion ultérieure.

Séparation cellulaire

1. Digestion: Placez les morceaux de tissu cisaillés dans un tube à centrifuger contenant la bonne quantité d'enzymes digestives et digérez dans un shaker ou un incubateur thermostaté à 37 ° C pendant un certain temps. Le tube de centrifugation peut être légèrement secoué pendant la période pour une digestion plus uniforme.

Arrêt de la digestion: lorsque la majeure partie du tissu est digérée en suspension unicellulaire ou en petites masses cellulaires, l'ajout d'un milieu contenant du sérum met fin à la digestion.

3. Filtration et centrifugation: la suspension cellulaire est filtrée avec un tamis cellulaire pour éliminer les débris de tissus non digérés, puis le filtrat est centrifugé à la vitesse de rotation appropriée pour recueillir les précipités cellulaires.

Observation et détection des cellules

1. Observation quotidienne: Observez la morphologie des cellules, l'état de croissance, la densité, etc. avec un microscope inversé tous les jours, enregistrez les changements cellulaires, tels que la découverte de la contamination cellulaire ou des anomalies, prenez les mesures appropriées en temps opportun.
2. Nombre de cellules et test de vitalité: lorsque nécessaire, les cellules peuvent être comptées et testées par des méthodes telles que la coloration au bleu Trypan pour comprendre la croissance et l'état de santé des cellules.

I. extraction et séparation

1. Opération rapide

- les tissus doivent être traités immédiatement après l'extraction, en évitant une exposition prolongée à la température ambiante ou à un environnement non nutritif.

- rincer les tissus avec du PBS stérile ou du sérum physiologique pour éliminer le sang, les impuretés.

2. Sélection des enzymes digestives

- sélectionnez les enzymes digestives en fonction du type de tissu et évitez les dommages cellulaires causés par une digestion excessive.

- le temps de digestion doit être strictement contrôlé (généralement 10 - 30 minutes) et l'état de dissociation cellulaire peut être observé au microscope.

II. Optimisation des conditions de culture

1. Sélection du milieu de culture

- l'utilisation de milieux contenant du sérum ou des facteurs de croissance spécifiques (par exemple dmem, rpmi 1640, etc.) nécessite l'ajout d'insuline, d'EGF, etc. à certaines cellules.

- Évitez les changements fréquents de marques ou de lots de milieu de culture et réduisez la pression d'adaptation cellulaire.

2. Mur et génération

- les cellules primaires ont une faible capacité d'application des parois et peuvent nécessiter une boîte de pétri (p. ex. collagène, polylysine).

- la densité au passage est recommandée pour être contrôlée à 70% - 80%, une confluence excessive peut entraîner une inhibition du contact et une différenciation.

Iii. Contrôle de la pollution

1. Opération stérile

- opération tout au long de la table ultra - propre, en utilisant des consommables jetables pour éviter la contamination croisée.

- un double anti peut être ajouté au milieu de culture, mais une utilisation prolongée peut affecter l'activité cellulaire.

2. Détection de mycoplasmes

- détection régulière de la contamination par Mycoplasma (par exemple par PCR), les cellules doivent être éliminées à temps après la contamination.

Iv. Surveillance de l'état

1. Observations quotidiennes

- vérifier la morphologie cellulaire, la densité et la couleur du milieu tous les jours et changer le milieu à temps (généralement tous les 2 - 3 jours).

- une morphologie anormale (par exemple, des cellules arrondies, une fragmentation accrue) peut suggérer une contamination ou des carences nutritionnelles.

2. Transmission et stockage par congélation

- le nombre de divisions cellulaires primaires est limité (généralement 5 - 10 générations) et les cellules secondaires précoces doivent être congelées à temps.

- le lyophilisat est recommandé avec du sérum DMSO + (ou un milieu de lyophilisation spécialisé) et l'azote liquide est conservé après refroidissement du gradient.