Cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines

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Endothélium microvasculaire du poumon humain isolé du tissu pulmonaire; Les poumons sont les organes respiratoires de l'organisme, situés dans la cavité thoracique, un à droite et un à gauche, couvrant le cœur. Les poumons ont des lobes divisés, deux à gauche et trois à droite, cinq lobes au total. Le système transpulmonaire (c'est - à - dire la trachée, les bronches, etc.) est relié au larynx et au nez, ce qui signifie que le larynx est le portail des poumons et que le nez est une astuce au - delà des poumons. Les cellules endothéliales microvasculaires sont étroitement impliquées dans une série de réactions physiologiques et inflammatoires, notamment la régénération, le développement et la cicatrisation des plaies. Les cellules sont fusiformes ou polygonales, disposées comme des cailloux ou des pavés après la formation d'une seule couche. Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires constituent une barrière semi - sélective, importante pour l'échange gazeux pulmonaire, régulant le flux de liquides et de solubles entre le sang et l'interstitium pulmonaire.

Introduction à la méthode:

L'endothélium microvasculaire pulmonaire humain isolé en laboratoire a été préparé à l'aide d'une méthode de collage tissulaire combinée à un criblage de culture de milieu spécifique pour les cellules endothéliales, pour un total de cellules d'environ 5 x 10 ⁵ cellules / flacon.

Détection de qualité:

L'endothélium microvasculaire pulmonaire humain isolé en laboratoire a été identifié par immunofluorescence CD31 jusqu'à une pureté supérieure à 90% et ne contient pas de VIH - 1, de VHB, de VHC, de mycoplasmes, de bactéries, de levures et de champignons, etc.

Le paquet est conditionnéPLL (0,1 mg / ML) ou gélatine (0,1%)

Milieu de cultureContient FBS, additifs de croissance, Penicillin, streptomycine, etc.

Fréquence de changement de liquideChangement de liquide tous les 2 - 3 jours

Caractéristiques de croissanceAppliquer le mur

Forme cellulaireCellules endothéliales comme

Caractéristiques des générationsTransmissible 2 - 3 générations

Liquide digestif0,25%

préparation

1. Préparation de l'équipement expérimental: préparer des boîtes de pétri stériles, des flacons de culture, des pipettes, des tubes de centrifugation, des instruments chirurgicaux, etc., et procéder à l'autoclave ou à d'autres traitements de désinfection appropriés.

2. Préparation des réactifs: formulez ou achetez le milieu de culture approprié, les enzymes digestives (par exemple, collagénase, etc.), le sérum de veau foetal, le double anti - réactif et d'autres réactifs, assurez - vous qu'ils sont stériles et dans la période de validité.

3. Préparation des animaux de laboratoire ou des tissus d'origine: selon les besoins de l'expérience, les tissus nécessaires sont obtenus en sélectionnant les animaux appropriés et en effectuant l'anesthésie ou la mise à mort correspondante; Ou obtenez une organisation à partir d'une bibliothèque d'échantillons d'organisation existante.

Matériaux et traitement

1. Extrait: dans des conditions stériles, retirer rapidement le tissu cible, minimiser les dommages aux tissus et éliminer l'excès de graisse, le tissu conjonctif et d'autres tissus non destinés.

2. Lavage: rincez le tissu retiré plusieurs fois avec du PBS stérile prérefroidi pour éliminer le sang et les impuretés.

3. Couper: couper le tissu en petits morceaux d'environ 1 - 2 mm³ pour une digestion ultérieure.

Séparation cellulaire

1. Digestion: Placez les morceaux de tissu cisaillés dans un tube à centrifuger contenant la bonne quantité d'enzymes digestives et digérez dans un shaker ou un incubateur thermostaté à 37 ° C pendant un certain temps. Le tube de centrifugation peut être légèrement secoué pendant la période pour une digestion plus uniforme.

Arrêt de la digestion: lorsque la majeure partie du tissu est digérée en suspension unicellulaire ou en petites masses cellulaires, l'ajout d'un milieu contenant du sérum met fin à la digestion.

3. Filtration et centrifugation: la suspension cellulaire est filtrée avec un tamis cellulaire pour éliminer les débris de tissus non digérés, puis le filtrat est centrifugé à la vitesse de rotation appropriée pour recueillir les précipités cellulaires.

Observation et détection des cellules

1. Observation quotidienne: Observez la morphologie des cellules, l'état de croissance, la densité, etc. avec un microscope inversé tous les jours, enregistrez les changements cellulaires, tels que la découverte de la contamination cellulaire ou des anomalies, prenez les mesures appropriées en temps opportun.
2. Nombre de cellules et test de vitalité: lorsque nécessaire, les cellules peuvent être comptées et testées par des méthodes telles que la coloration au bleu Trypan pour comprendre la croissance et l'état de santé des cellules.

I. extraction et séparation

1. Opération rapide

- les tissus doivent être traités immédiatement après l'extraction, en évitant une exposition prolongée à la température ambiante ou à un environnement non nutritif.

- rincer les tissus avec du PBS stérile ou du sérum physiologique pour éliminer le sang, les impuretés.

2. Sélection des enzymes digestives

- sélectionnez les enzymes digestives en fonction du type de tissu et évitez les dommages cellulaires causés par une digestion excessive.

- le temps de digestion doit être strictement contrôlé (généralement 10 - 30 minutes) et l'état de dissociation cellulaire peut être observé au microscope.

II. Optimisation des conditions de culture

1. Sélection du milieu de culture

- l'utilisation de milieux contenant du sérum ou des facteurs de croissance spécifiques (par exemple dmem, rpmi 1640, etc.) nécessite l'ajout d'insuline, d'EGF, etc. à certaines cellules.

- Évitez les changements fréquents de marques ou de lots de milieu de culture et réduisez la pression d'adaptation cellulaire.

2. Mur et génération

- les cellules primaires ont une faible capacité d'application des parois et peuvent nécessiter une boîte de pétri (p. ex. collagène, polylysine).

- la densité au passage est recommandée pour être contrôlée à 70% - 80%, une confluence excessive peut entraîner une inhibition du contact et une différenciation.

Iii. Contrôle de la pollution

1. Opération stérile

- opération tout au long de la table ultra - propre, en utilisant des consommables jetables pour éviter la contamination croisée.

- un double anti peut être ajouté au milieu de culture, mais une utilisation prolongée peut affecter l'activité cellulaire.

2. Détection de mycoplasmes

- détection régulière de la contamination par Mycoplasma (par exemple par PCR), les cellules doivent être éliminées à temps après la contamination.

Iv. Surveillance de l'état

1. Observations quotidiennes

- vérifier la morphologie cellulaire, la densité et la couleur du milieu tous les jours et changer le milieu à temps (généralement tous les 2 - 3 jours).

- une morphologie anormale (par exemple, des cellules arrondies, une fragmentation accrue) peut suggérer une contamination ou des carences nutritionnelles.

2. Transmission et stockage par congélation

- le nombre de divisions cellulaires primaires est limité (généralement 5 - 10 générations) et les cellules secondaires précoces doivent être congelées à temps.

- le lyophilisat est recommandé avec du sérum DMSO + (ou un milieu de lyophilisation spécialisé) et l'azote liquide est conservé après refroidissement du gradient.