Cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines

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Séparation endothéliale microvasculaire rétinienne humaine du tissu rétinien autorétinien; La rétine réside dans la couche interne de la paroi oculaire et est un film transparent. La rétine est composée d'une couche épithéliale pigmentée et d'une couche rétinosensorielle, entre deux couches pouvant être séparées dans une situation pathologique, appelée décollement rétinien. La couche épithéliale pigmentaire est étroitement liée à la choroïde et se compose de cellules épithéliales pigmentaires qui ont des rôles tels que le soutien et la nutrition des cellules photoréceptrices, l'occultation de la lumière, la dissipation de la chaleur et la régénération et la réparation. Histologiquement, la rétine est divisée en10 couches, respectivement: couche épithéliale pigmentaire, cône optique, couche de cellules de tige, membrane externe, couche de particules externes, couche plexus externe, couche de particules internes, couche plexus interne, couche de cellules ganglionnaires, couche de fibres nerveuses, membrane limite interne. La couche interne de la rétine est un film mince qui tapisse la face interne de la membrane vasculaire, a un effet photosensible; Il y a un papillon du nerf optique sur le côté nasal arrière. La couche sensorielle sur la rétine est composée de trois neurones. Les neurones sont des couches de cellules optiques, sensibles à la lumière, qui comprennent des cônes et des bâtonnets. Les bâtonnets se trouvent principalement sur la rétine, plus loin de la concavité centrale, tandis que les cônes sont les plus nombreux dans la concavité centrale. La deuxième couche, appelée biganocytes, compte environ 10 à plusieurs centaines de cellules optiques reliées à une cellule ganglionnaire par l'intermédiaire d'un biganocyte, responsable de l'action de liaison. La troisième couche, appelée couche ganglionnaire, conduit par sonde. La rétine est une structure mince mais très complexe qui s'applique à la paroi arrière du globe oculaire et les fibres nerveuses qui transmettent les impulsions des récepteurs rétiniens traversent la surface de la rétine pour atteindre la sortie via le nerf optique. La résolution de la rétine est inégale et, dans la zone maculaire, elle est forte. C'est une seule couche de cellules épithéliales plates qui composent la surface de la cavité vasculaire, les substances biologiquement actives qu'elle produit et sécrète ont un rôle important dans le maintien du tonus vasculaire, la régulation de la pression artérielle, l'antithrombose, etc., et ont une importance physiopathologique importante dans la pathogenèse des maladies vasculaires rétiniennes. Étant donné que les cellules endothéliales obtenues à partir de différents tissus et organes ont des propriétés différentes, dans le cerveau et la rétine, ces cellules endothéliales ont la fonction de barrière interne et jouent un rôle important dans la régulation de l'état physiologique des vaisseaux sanguins, la libération de substances vasoactives ainsi que dans la formation de néovaisseaux sanguins, les cultures isolées in vitro rcec ont une importance clinique importante pour l'étude des mécanismes physiopathologiques du développement des maladies vasculaires de la rétine ainsi que pour la lutte précoce contre la maladie.
Introduction à la méthode:

Entreprise laboratoire endothélium microvasculaire rétinien humain isolé avec collagénase- la méthode de digestion mixte à la dan - leucose neutre combinée à la centrifugation à gradient de densité et finalement préparée par criblage de cultures de milieux spécialisés pour les cellules endothéliales, le total des cellules est d'environ 5 × 10? Cellules / bouteilles.
Détection de qualité:

Entreprise laboratoire endothélium microvasculaire rétinien humain isoléLe CD31 est identifié par immunofluorescence avec une pureté pouvant atteindre plus de 90% et ne contient pas de VIH - 1, de VHB, de VHC, de mycoplasmes, de bactéries, de levures et de champignons, etc.

Le paquet est conditionné PLL（0.1mg/ml）， Gélatine (0,1%)

Milieu de culture ContientFBS、 Additifs de croissance, Penicillin, streptomycine, etc.

Fréquence de changement de liquide chaque2 - 3 jours pour changer de liquide une fois

Caractéristiques de croissance Appliquer le mur

Forme cellulaire Cellules endothéliales comme

Caractéristiques des générations Transmissible2 - 3 générations

Liquide digestif 0,25% protéase Yi

Conditions de culture Phase gazeuse: air,95%； CO2, 5 %

préparation

1. Préparation de l'équipement expérimental: préparer des boîtes de pétri stériles, des flacons de culture, des pipettes, des tubes de centrifugation, des instruments chirurgicaux, etc., et procéder à l'autoclave ou à d'autres traitements de désinfection appropriés.

2. Préparation des réactifs: formulez ou achetez le milieu de culture approprié, les enzymes digestives (par exemple, collagénase, etc.), le sérum de veau foetal, le double anti - réactif et d'autres réactifs, assurez - vous qu'ils sont stériles et dans la période de validité.

3. Préparation des animaux de laboratoire ou des tissus d'origine: selon les besoins de l'expérience, les tissus nécessaires sont obtenus en sélectionnant les animaux appropriés et en effectuant l'anesthésie ou la mise à mort correspondante; Ou obtenez une organisation à partir d'une bibliothèque d'échantillons d'organisation existante.

Matériaux et traitement

1. Extrait: dans des conditions stériles, retirer rapidement le tissu cible, minimiser les dommages aux tissus et éliminer l'excès de graisse, le tissu conjonctif et d'autres tissus non destinés.

2. Lavage: rincez le tissu retiré plusieurs fois avec du PBS stérile prérefroidi pour éliminer le sang et les impuretés.

3. Couper: couper le tissu en petits morceaux d'environ 1 - 2 mm³ pour une digestion ultérieure.

Séparation cellulaire

1. Digestion: Placez les morceaux de tissu cisaillés dans un tube à centrifuger contenant la bonne quantité d'enzymes digestives et digérez dans un shaker ou un incubateur thermostaté à 37 ° C pendant un certain temps. Le tube de centrifugation peut être légèrement secoué pendant la période pour une digestion plus uniforme.

Arrêt de la digestion: lorsque la majeure partie du tissu est digérée en suspension unicellulaire ou en petites masses cellulaires, l'ajout d'un milieu contenant du sérum met fin à la digestion.

3. Filtration et centrifugation: la suspension cellulaire est filtrée avec un tamis cellulaire pour éliminer les débris de tissus non digérés, puis le filtrat est centrifugé à la vitesse de rotation appropriée pour recueillir les précipités cellulaires.

Observation et détection des cellules

1. Observation quotidienne: Observez la morphologie des cellules, l'état de croissance, la densité, etc. avec un microscope inversé tous les jours, enregistrez les changements cellulaires, tels que la découverte de la contamination cellulaire ou des anomalies, prenez les mesures appropriées en temps opportun.
2. Nombre de cellules et test de vitalité: lorsque nécessaire, les cellules peuvent être comptées et testées par des méthodes telles que la coloration au bleu Trypan pour comprendre la croissance et l'état de santé des cellules.

I. extraction et séparation

1. Opération rapide

- les tissus doivent être traités immédiatement après l'extraction, en évitant une exposition prolongée à la température ambiante ou à un environnement non nutritif.

- rincer les tissus avec du PBS stérile ou du sérum physiologique pour éliminer le sang, les impuretés.

2. Sélection des enzymes digestives

- sélectionnez les enzymes digestives en fonction du type de tissu et évitez les dommages cellulaires causés par une digestion excessive.

- le temps de digestion doit être strictement contrôlé (généralement 10 - 30 minutes) et l'état de dissociation cellulaire peut être observé au microscope.

II. Optimisation des conditions de culture

1. Sélection du milieu de culture

- l'utilisation de milieux contenant du sérum ou des facteurs de croissance spécifiques (par exemple dmem, rpmi 1640, etc.) nécessite l'ajout d'insuline, d'EGF, etc. à certaines cellules.

- Évitez les changements fréquents de marques ou de lots de milieu de culture et réduisez la pression d'adaptation cellulaire.

2. Mur et génération

- les cellules primaires ont une faible capacité d'application des parois et peuvent nécessiter une boîte de pétri (p. ex. collagène, polylysine).

- la densité au passage est recommandée pour être contrôlée à 70% - 80%, une confluence excessive peut entraîner une inhibition du contact et une différenciation.

Iii. Contrôle de la pollution

1. Opération stérile

- opération tout au long de la table ultra - propre, en utilisant des consommables jetables pour éviter la contamination croisée.

- un double anti peut être ajouté au milieu de culture, mais une utilisation prolongée peut affecter l'activité cellulaire.

2. Détection de mycoplasmes

- détection régulière de la contamination par Mycoplasma (par exemple par PCR), les cellules doivent être éliminées à temps après la contamination.

Iv. Surveillance de l'état

1. Observations quotidiennes

- vérifier la morphologie cellulaire, la densité et la couleur du milieu tous les jours et changer le milieu à temps (généralement tous les 2 - 3 jours).

- une morphologie anormale (par exemple, des cellules arrondies, une fragmentation accrue) peut suggérer une contamination ou des carences nutritionnelles.

2. Transmission et stockage par congélation

- le nombre de divisions cellulaires primaires est limité (généralement 5 - 10 générations) et les cellules secondaires précoces doivent être congelées à temps.

- le lyophilisat est recommandé avec du sérum DMSO + (ou un milieu de lyophilisation spécialisé) et l'azote liquide est conservé après refroidissement du gradient.