Dépistage de cellules positives pour l'édition de gènes

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Vue d'ensemble

Le criblage de cellules positives pour l'édition de gènes se réfère à l'identification et à l'isolement de cellules qui ont subi avec succès une modification génétique ciblée par une méthode spécifique après une expérience d'édition de gènes telle que crispr / cas9. Les méthodes de dépistage couramment utilisées comprennent le dépistage antibiotique (par exemple, en utilisant des marqueurs génétiques de résistance), le dépistage de marqueurs de protéines fluorescentes, la vérification par PCR ou par séquençage, etc. Ce processus est essentiel pour obtenir des lignées cellulaires mutantes homozygotes ou hétérozygotes, étudier la fonction des gènes ou réaliser des modèles de maladies.

Détails du produit

Dépistage de cellules positives pour l'édition de gènes: stratégie technique et optimisation des processus

Le dépistage des cellules positives est le lien central de l'édition de gènes et son efficacité affecte directement le cycle et le succès des expériences.

I. filtrer les objectifs et les défis

Objectifs fondamentaux

Les cellules éditées avec succès (par exemple, Knock - out / Ko, Knock - in / ki) ont été isolées à partir de populations cellulaires mixtes.
Exclure les interférences cellulaires de type sauvage (prédisposition aux faux négatifs lorsque la proportion de cellules non éditées est élevée).

Les principaux défis

Dommages cellulaires: le dépistage à long terme entraîne un vieillissement cellulaire (chute de la capacité proliférative des fibroblastes porcins après passage).
Risque de faux positifs: l'édition partielle n'a pas complètement perturbé la fonction du gène (par exemple, la mutation de décalage n'a pas entraîné de perte fonctionnelle).
Goulot d'étranglement du flux: les cultures monoclonales traditionnelles prennent plus de 22 jours et ont un taux de positivité inférieur à 20%.

II. Principales techniques de filtrage et processus opérationnels

(i) technologie d'enrichissement basée sur un système de reporting

Utilisation de mécanismes de réparation pour déclencher l'expression de marqueurs fluorescents / résistants permettant une visualisation et un tri rapide:

Mécanisme de réparation	Conception du système de reporting	Méthode de filtrage	Avantages	CAS
numérique	Destruction ciblée des terminateurs de protéines fluorescentes → restauration de l'expression	FACS Trie les cellules gfp⁺	Intuitif et efficace pour ko	Crispr - DIY transporteur
HDR	Gène de résistance à l'insertion recombinante homologue (p. ex. puroᵣ)	Dépistage de pression antibiotique	Convient pour ki, faible coût	Beyoncé crispr plasmide
SSA	Réparation par recuit simple brin induite par fracture → reconstitution de protéines fluorescentes	Cytométrie de flux	Sensibilité élevée, faible taux de ciblage	Vérification de l'édition génétique multiple

Procédure opérationnelle(prenez le système nhej - GFP comme exemple):

Construire avecTerminateur GFP - TAAVecteur d'édition (sgrna ciblant la région TAA).

Après transfection des cellules, nhej répare l'expression du Terminateur → GFP.

Utilisation après 72HCytométrie de flux (comme ique ®） Tri des cellules gfp⁺- Oui.

(II) Méthode d'identification rapide des cellules traces

Programme révolutionnaire: seulement 50 cellules sont nécessaires pour compléter l'identification du génotype et raccourcir le cycle de plus de 15 jours.

Paramètres clésPour:

Quantité de cellules: ≥ 50 (taux de détection insuffisant pour 20 groupes cellulaires, p < 0,01).
Sensibilité de coupure enzymatique: t7e1 peut détecter ≥ 5% d'efficacité d'édition.
Étapes de vérification: le séquençage Sanger confirme le type de mutation (par exemple insertion / délétion).

(III) techniques de vérification du clivage enzymatique et du séquençage

méthode	Le principe	Scénarios d'application	Limitations
Coupe enzymatique t7e1	La coupe mal appariée produit une double chaîne hétérologue	Tamis initial (faible coût)	Faible sensibilité (≥ 5% d'édition)
Séquençage Sanger	Lecture directe des variations de séquence	Validation monoclonale	Faible flux
Séquençage à haut débit	Mutation du site cible de couverture profonde	Analyse multigénique / hors cible	成本高

Optimisation opérationnellePour:

Pré - tamisage de clonage mixte: taux d'édition de la population de détection par fa - PCR, > 30% de monoclones re - triés.

Politique de double validation: t7e1 clone positif au tamis primaire → confirmation par séquençage Sanger (éviter les faux positifs).

Iii. Choix de la technologie et adaptation de la scène

(i) Sélection par type de cellule

Types de cellules	Méthode recommandée	Les raisons
Cellules primaires	Méthode d'identification des microcellules	Eviter le vieillissement par culture à long terme (fibroblastes porcins)
Lignée cellulaire tumorale	Dépistage antibiotique + FACS	Prolifération rapide, résistance stable
iPSCs	Système de reporting HDR + séquençage monoclonal	Maintenir la polyvalence, nécessite une édition de haute précision

(II) Sélection par type d'édition

Type d'édition	Techniques de filtrage	Indicateurs clés
Knockout génétique (Ko)	Système de reporting nhej - GFP	Proportion de cellules gfp⁺ (quantification en flux)
Knock - in génétique (ki)	Dépistage antibiotique + vérification PCR	Survie à la résistance + amplification des séquences flanquantes
Mutation ponctuelle (PM)	T7e1 + séquençage en profondeur	Fréquence de mutation & gt; 90%

Dépistage de cellules positives pour l'édition de gènes

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