ZFN modèles animaux

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Vue d'ensemble

Modèles animaux ZFN: les modèles animaux de nucléases à doigt de zinc (ZFN) sont des modèles animaux expérimentaux construits à l'aide de techniques d'édition de gènes de nucléases à doigt de zinc. Les nucléases à doigt de zinc sont formées par fusion d'une protéine à doigt de zinc (zfp), capable de se lier spécifiquement à une séquence d'ADN cible, et d'une nucléase (foki), qui est responsable de la coupure de l'ADN, introduisant ainsi des ruptures à double brin sur des sites génétiques spécifiques, induisant des mécanismes de réparation cellulaire permettant le Knockout, le Knock - in ou la mutation.

Détails du produit

Un,ZFN modèles animauxPrincipes techniques et mécanismes de base

Les ZFN sontOutils d'édition de gènes programmables de première génération, par fusionDomaine de liaison ADN(protéine à doigt de zinc) avecDomaine de coupe d'ADN(foki nucléase) Réalisation de l'édition ciblée:

Domaine de protéine de doigt de zincPour:

Par30 - 34 unités répétées d'acides aminésComposition, chaque unité passe parRésidus variables aux positions 12 et 13 (RVD)Identifier une base spécifique:

Type de RVD	Identification des bases	Spécificité
NI	Un	Haute
NG	T	Haute
HD	C	Haute
NN	G/A	Moyenne

Identification des doigts de zinc individuels3 pb, 3 - 6 peuvent être ciblés en série9 à 18 pbLa séquence.

Domaine de coupe fokiPour:

NécessaireDimérisationPour activer la fonction de coupe → les ZFN doivent être conçus par paires (bras gauche / droit), le site de coupe étant situé entre les sites de fixation des deux bras (zone d'espacement 5 - 7 BP).

Mécanisme d'éditionPour:

Rupture double brin (DSB) → les cellules initient un chemin de réparation:

Connexion terminale non homologue (nhej): insertion / délétion aléatoire (indels), entraînant le Knockout.
Réparation directionnelle homologue (HDR): nécessite un modèle de réparation exogène (par exemple, ssodn) pour réaliser des mutations ponctuelles ou des insertions génétiques.

Percée technologique: Shou mise en œuvreÉdition ciblée du génome des mammifères(2005), ouvrant l'ère de l'édition génétique de précision.

Deux,ZFN modèles animauxOptimisation des processus et de la technologie

(i) Étapes opérationnelles normalisées

(II) Optimisation des paramètres techniques clés

étape	Opérations de base	Optimisation innovante
Conception de cibles	Éviter les zones à forte répétition / méthylation, espaceur 5 - 7 pb	Prédiction logicielle (zifit) améliore l'efficacité de la combinaison
Assemblage de doigts de zinc	Méthode tandem modulairePour:

3 - 6 unités de doigt de zinc en série
Golden Gate clone (BSAI / bsmbi) | construction terminée en 6 jours, taux de réussite > 80% |
|Vecteur d'expression| vecteur double promoteur (CMV / t7) supportant la synthèse d'ARNm et l'expression de protéine | adaptation Multi - espèces (poisson zèbre, souris, porc) |
|Mode de livraison| - microinjection d'ARNm zfns dans l'œuf fécondé
Transfection somatique + transplantation nucléaire (grands animaux) | réduction de la délivrance d'ARNm
|Amélioration de la réparation| modèle combiné ssodn + inhibiteur nhej (scr7) | efficacité HDR multipliée par 3 |

Iii. Cas d'application Multi - espèces et avantages du modèle

(i) espèces typiques et modèles de maladies

Espèces	Gènes cibles	Modèle de la maladie	Efficacité / phénotype	Valeur de la recherche
Poisson zèbre	doré	Albinisme	Absence de 95% des pigments de la génération f0	Dépistage fonctionnel des gènes du développement
Souris	Rag2/IL2rg	Modèle d'immunodéficience	Double Knockout, plateforme de transplantation humanisée	Étude sur le traitement sans Yi des tumeurs
porc	GGTA1	Modèle de transplantation de xénotrope Guan	Knockout de l'antigène alpha - gal pour réduire le rejet ultra - aigu	Développement d'organes humanisés
La mouche des fruits	jaune	Mutations de couleur corporelle	Taux de mutation de la lignée germinale 5,7% (modèles animaux)	Vérification de la conservation fonctionnelle des gènes

Ii) scénarios d'application de l'irremplaçabilité

High GC région ModifierPour:

Sans restriction de séquence PAM, il est possible de cibler des zones que crispr / cas9 ne peut pas modifier.

Faible besoin de taux de désactivationPour:

Taux de désactivation < 0,1% (1 - 10% pour crispr) dans l'édition thérapeutique.

Grands modèles animauxPour:

L'immunogénicité est inférieure à celle de crispr chez les espèces porcines, bovines, etc.

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