Expériences de transfection lentivirale

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Vue d'ensemble

Une expérience de transfection lentivirale est une technique qui utilise un vecteur Lentiviral modifié pour importer de manière stable des gènes exogènes dans une cellule hôte. Les Lentivirus appartiennent aux rétrovirus et ont la capacité d'infecter des cellules divisées et non divisées, d'intégrer des gènes d'intérêt dans le génome de l'hôte et d'obtenir une expression stable à long terme. Cette technologie est largement utilisée dans des domaines tels que la recherche sur la fonction génétique, la thérapie génique et la préparation de cellules souches pluripotentes induites (cellules IPS).

Détails du produit

Un,Expériences de transfection lentiviraleDéfinition technique et valeurs fondamentales

Transfection de LentivirusEst l'utilisation de vecteurs lentiviraux modifiés pour délivrer des gènes exogènes aux cellules cibles, permettantExpression stable à long termeTechniques d'importation de gènes. Ses principaux avantages comprennent:

Applicabilité cellulaire à large spectre: peut infecter les cellules divisées par rapport aux cellules non divisées (p. ex., neurones, cellules souches, cellules primaires), dépassant les limites de la transfection traditionnelle.
Intégration efficace de l'expression: l'ARN viral est intégré au génome de l'hôte après transcription inverse en ADN, permettant l'expression de longue durée du gène exogène.
Faible immunogénicité: suppression des gènes pathogènes viraux (par exemple, le VIHtatEt,rev), réduit significativement la réponse immunitaire de l'hôte.
Facilité de fonctionnement: sans réactifs de transfection complexes, infection directe des cellules par des particules virales.

Identification des termesPour:

Transfection (transfection): se réfère généralement à l'importation d'acides nucléiques non médiée par le virus (par exemple, électroporation, liposomes).

Transduction (transduction): se réfère spécifiquement à la transmission de gènes à médiation virale, la technologie lentivirale appartient à cette catégorie.

Deux,Expériences de transfection lentiviraleMécanismes moléculaires: de l'emballage viral à l'intégration génétique

(i) Constitution du système de vecteurs lentiviraux

Composants	fonction	Evolution technologique
Transfert du plasmide	Portant des gènes exogènes (par exemple, adnc, shrna) et des signaux d'emballage (₃)	Vecteur de troisième génération Supprimertat, utiliser plutôt la transcription CMV - promotor - driven
Emballage plasmide	Expression de protéines structurales virales (gag, POL)	Segmentation en deux plasmides gag / POL et Rev, réduction du risque de recombinaison
Enveloppe protéine Granules	Expression de la protéine VSV - G (Protéine G du virus de la stomatite furonculeuse), déterminant la gamme d'hôtes	Remplacement de l'enveloppe naturelle du VIH, élargissement des types de cellules infectées
Plasmides auxiliaires	Fournit la protéine Rev qui favorise la nucléation de l'ARN non épissé	Augmentation de la production de virus

(II) Processus de livraison de gènes au sein de la cellule hôte

Entrée du virus: la protéine VSV - g se lie à un récepteur de la membrane cellulaire cible (par exemple, LDLR) qui Médie la fusion membranaire.
Transcription et entrée au noyau: l'ARN viral est transcrit en adnc dans le cytoplasme et transporté à l'intérieur du noyau par le complexe pré - intégration (PIC).
Intégration génomique: l'Intégrase virale (integrase) insère aléatoirement l'adnc dans le Chromosome hôte pour permettre l'expression de la persistance du Yong.

Iii. Processus opérationnels standard et optimisation technique

(i) Conditionnement et purification du virus (exemple: cellules 293t)

étape	Points opérationnels	Normes de contrôle de qualité
Co - transfection plasmidique	Système quadriplasmidique (transfert + Conditionnement + enveloppe + Adjuvant) transfection de cellules 293t, 48 - 72 heures de collecte	Pureté du plasmide & gt; 1,8 (a260 / A280), sans endotoxines
Concentration de virus	Ultracentrifugation (50 000 × g) ou méthode de précipitation PEG, amélioration du titre 10 - 100 fois	Titre après concentration & gt; 1 × 10 ⁸ ifu / ml
Détermination du titre	Cytométrie de flux (gène Rapporteur Fluorescent) ou QPCR (nombre de copies du génome viral)	Un titre fonctionnel (tu / ML) > 10⁷ est qualifié

(II) transfection et criblage des cellules cibles

Optimisation des conditions infectieusesPour:

L'addition d'une polycoagulamine (polybrene, 8 µg / ML) améliore l'adsorption virale.
Test du nombre complexe d'infections (moi): généralement moi = 5 - 20 (ajusté en fonction du type de cellule).

Dépistage des souches stablesPour:

Criblage antibiotique: traitement à la puromycine (1 µg / ML) pendant 7 à 14 jours, élimination des cellules non transfectées.
Amplification monoclonale: des souches cellulaires homogènes sont obtenues par dilution limitée.

Techniques clésPour:

Les cellules qui ne se divisent pas, comme les neurones, doivent prolonger l’infection jusqu’à 72 heures.

Les cellules primaires recommandent d'éviter la toxicité avec un moi faible (≤ 5).

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